聚焦CRO｜疫苗临床前安全性评价研究关注点

         在新冠疫苗全球研发竞赛中，公众看到了惊人的研发速度，但鲜为人知的是，每个成功疫苗的背后都经历了严谨的临床前研究阶段。它不仅是确保疫苗安全性的“第一道防线”，更是推动疫苗顺利进入临床阶段的核心环节。作为连接基础研究与人体试验的核心环节，临床前研究承担着验证疫苗安全性与有效性的双重使命。

 

一、疫苗是什么？

         预防用生物制品（以下简称疫苗）系指含有抗原、能够诱导人体产生特异性主动免疫的制剂，它可以保护机体免受感染原、毒素，以及感染原引起的抗原性物质的损伤。

         与自然感染一样，疫苗通过启动先天免疫反应发挥作用，进而激活抗原特异性适应性免疫反应。先天免疫是抵御进入体内的病原体的第一道防线。它在数小时内建立，但对特定病原体不具有特异性，也没有记忆。适应性免疫提供了第二道防线，通常在感染的后期阶段，其特征是一组非常多样化的淋巴细胞和抗体能够识别和消除几乎所有已知的病原体。每种病原体（或疫苗）都表达（或包含）抗原，这些抗原通过激活高度特异性的 T 淋巴细胞亚群来诱导细胞介导的免疫，并通过刺激 B 淋巴细胞产生特异性抗体来诱导体液免疫。消除病原体后，适应性免疫系统通常会建立免疫记忆。这种免疫记忆是长期保护的基础和疫苗接种的目标，其特征是抗体的持续存在和记忆细胞的产生，这些记忆细胞在随后暴露于相同的病原体时可以迅速重新激活^[1]。

 

获得性免疫和疫苗免疫^[2]

 

二、疫苗临床前安全性评价

         疫苗设计在上个世纪取得了重大进展，由于对免疫机制和技术的理解取得了进步，从偶然发展为更合理的设计^[3]。根据感染的生物学特性和要预防的疾病，疫苗可能需要诱导不同的体液（即抗体）或细胞介导的（即 T 细胞）适应性免疫机制才能有效。因此，了解疫苗的作用方式对于预测其功效、安全性以及它们对接种疫苗的个体和普通人群的预期益处非常重要^[4]。各监管机构也都根据其特点颁布了相应的法规，如有相关需求，可参考附录1。本文适用于创新的灭活疫苗、减毒活疫苗、纯化疫苗、重组DNA技术制备的抗原疫苗、结合疫苗、合成肽疫苗，以及使用新佐剂的疫苗的动物安全性评价研究。

 

         临床前动物安全性评价的主要目的系通过相关动物来考察疫苗的安全性，包括对免疫器官和其它毒性靶器官的影响、毒性的可逆性，以及与临床相关的参数，预测其在大规模人群中使用时可能出现的不良反应，降低临床试验受试者和临床使用者承担的风险，并为临床试验方案的制订提供依据。

 

疫苗的主要类型^[2]

 

2.1 疫苗临床前安全性评价研究关注点

         疫苗可能导致的毒性反应主要包括：制品成分本身作为毒性物质对机体的直接损伤、诱导免疫系统引起的与免疫相关的毒性，以及污染物和残余杂质引起的毒性。由于疫苗系通过诱导免疫系统产生抗体及/或效应T细胞发挥作用，因此其最主要的潜在毒性来自与免疫系统相关的毒性，常规药物安全性评价的方法并不完全适用于疫苗^[4]。

 

2.1.1 长期毒性试验

项目	具体要求与说明
动物选择	至少选择一种相关动物进行长期毒性试验 需确保动物对疫苗产生免疫应答（选择试验动物的最低要求） 由于尚不清楚幼年动物免疫器官的发育状态，及其与婴儿或儿童之间的相关性或差别，因此目前不推荐仅采用幼年动物进行拟用于婴儿和儿童的疫苗的毒理学研究。
接种剂量	原则：使疫苗在动物体内达到最佳免疫应答。 方法：通过免疫原性试验筛选最佳剂量，或直接采用临床试验拟用高剂量（按人份计）。 特殊情况： 小型动物因体积限制，可采用同途径多点给药。- 佐剂引发严重炎症时，可适当降低剂量。 禁止改变疫苗处方以提高抗原浓度。 不推荐通过体表面积折算剂量。
接种次数	至少比临床拟定的接种次数多一次。
接种频率	无需每日给药。 暴露间隔根据动物免疫应答确定，通常为2-3周（因抗体形成需2-3周达稳定期）。
观测指标	常规指标：外观体征、行为活动、体温、局部刺激性、腺体分泌、粪便性状、摄食量、体重、血液学/血液生化学指标（如白细胞分类、白蛋/球蛋白比例、血清酶等）、大体解剖及组织病理学检查。 重点指标：免疫相关细胞、组织及器官（如胸腺、脾脏、骨髓、淋巴结等）。 组织病理学检查范围： 注射局部及附近引流淋巴结、胸腺、脾脏、骨髓、派氏集合淋巴结或支气管伴随淋巴结。 脑、肝、肾、生殖系统等关键器官。 特殊接种途径可能影响的器官。 特殊安全性问题：若发现潜在风险（如超敏反应、自身免疫性疾病、杂质毒性等），需针对性考察特定指标并进一步研究。
观测时间	血液学/生化学指标： 首次接种后1-3天。 末次接种后1-3天及2-3周。 解剖与病理检查： 末次接种后立即检查。 末次接种后2-3周（恢复期）。

补充说明：

• 免疫原性验证：长期毒性试验需同步考察免疫原性，以确认动物选择的合理性。
• 动态调整：根据初步观测结果或理论风险，灵活增加特定毒理学研究。

 

2.1.2 急性毒性试验

• 采用一种动物（不一定是相关动物）进行的急性毒性试验就能够反映出疫苗对机体的直接损伤，为临床使用提供安全范围参考。

 

2.1.3局部刺激性试验

• 应重点观察疫苗的局部刺激性，疫苗的局部刺激性试验应根据临床拟用给药途径进行。本试验可单独进行，也可结合长期试验进行。

 

2.1.4过敏试验

• 由于疫苗在临床上很可能引起超敏反应，因此应在临床前完成常规豚鼠主动过敏试验。

 

2.1.5生殖毒性试验

项目	具体要求与说明
适用人群与试验要求	儿童疫苗：一般不进行生殖毒性试验。 妊娠妇女疫苗：必须进行生殖毒性试验。 可能妊娠妇女疫苗：若无临床证据排除生殖毒性担忧，应考虑进行试验。
试验目的与范围	主要考察疫苗对动物胚胎和幼仔发育的影响（因免疫应答可能干扰胚胎/新生儿发育）。
动物选择	选用敏感动物进行试验。
接种时间与频率	接种时机：通常在动物交配前接种，确保妊娠全程暴露。 间隔与加强：根据免疫应答确定接种间隔，必要时妊娠期间加强免疫以维持最佳应答。
观测指标	基本指标：活胎数、吸收胎数、流产数、胎体重量、形态学检查、幼仔断乳前生存率、体重及体重增长。 补充指标（必要时）：脐带或胚胎血液中的抗体水平（评估胚胎抗体暴露）。
特殊说明	试验设计需确保动物妊娠期间充分暴露于疫苗诱导的免疫应答。

补充说明：

• 试验必要性：妊娠妇女疫苗的生殖毒性试验为强制要求，其他人群需根据风险判断。
• 抗体水平检测：仅在需要明确胚胎抗体暴露时补充检测。

 

2.1.6其它特殊考虑

要点分类	具体内容
免疫原性试验与保护力试验	试验目的： 评估疫苗在动物体内引发的体液免疫（测定血清中和抗体效价）或细胞免疫应答。 在可能情况下进行保护力试验，验证疫苗对动物的保护作用。 作用： 支持疫苗进入临床试验。 为安全性评价（动物选择、剂量/途径/频率设计）和临床试验方案提供依据。
佐剂	定义与机制： 非特异性免疫增强剂，与抗原联用可增强或改变免疫应答类型。 作用方式：延长抗原潴留时间、增强抗原处理/提呈能力、刺激淋巴细胞增殖分化。 研究要求： 新型佐剂（未上市且缺数据）：需单独进行常规急性毒性、28天长期毒性、生殖毒性、遗传毒性、局部刺激性、免疫毒理试验，必要时研究组织分布特性。 蛋白类佐剂：需考虑种属特异性。 试验设计： 使用佐剂的疫苗需在长期毒性、免疫原性及保护力试验中设置模拟疫苗（无抗原但工艺相同）对照组。
其他研究要求	常规豁免：疫苗通常无需进行一般药理学、遗传毒性、致癌性及常规药代动力学研究。  特殊要求： 某些特殊疫苗(mRNA疫苗[5]、病毒载体疫苗（如腺病毒、VSV载体）[6]、DNA疫苗[7]、纳米颗粒疫苗（如LNP、聚合物载体）[8]、新型减毒活疫苗（如基因编辑减毒株）[7])需进行组织分布研究，重点关注注射局部及附近引流淋巴结（反映局部滞留特点），同时考察主要脏器。

 

三、经典案例解析

ChAdOx1-S（腺病毒载体）^[9]

• 载体选择：ChAdOx1-S使用一种改良的黑猩腺病毒（ChAdOx1） 作为载体。腺病毒本身经过基因改造，无法在人体内复制，因此安全性较高。
• 基因插入：ChAdOx1-S载体携带 SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白） 的基因序列（AZD1222）。接种后，S蛋白在人体细胞内表达，触发免疫系统产生针对新冠病毒的抗体和T细胞免疫应答。

 

3.1 组织分布

         在ChAdOx1-S腺病毒载体疫苗的临床前评价中，实验采用小鼠、仓鼠及恒河猴模型，以临床等效剂量（5×10¹⁰病毒颗粒/剂）单次或重复注射，通过qPCR和免疫组化分析载体分布。

         结果显示：靶向分布方面，载体DNA在注射部位（肌肉）24小时达峰，28天完全清除，引流淋巴结持续表达S蛋白，激活免疫应答；全身分布中，肝/脾仅短暂检出低水平载体信号（7天内清除），生殖腺及脑组织未检出DNA，排除整合风险。28天后所有组织无残留，验证了复制缺陷型载体的安全清除特性。综上，ChAdOx1-S的分布模式符合设计预期，无蓄积或长期毒性，支持AZD1222两剂5×1010病毒颗粒的临床方案^[10]。

 

3.2重复给药毒性

         多项基于ChAdOx1/AdCh63平台的临床前研究（如ChAdOx1-MERS、AdCh63 MSP-1等）证实AZD1222安全性，均符合GLP标准。小鼠模型中两剂肌肉注射（0.78-1×1010病毒颗粒，间隔14天）显示低毒性，不良反应与正常免疫反应相关。

         关键毒性研究（513351[9]）中，小鼠接受3.7×1010病毒颗粒/剂（第1/22/43天给药），观察到雄性短暂体温升高（24小时恢复）、第45天单核细胞轻度下降（雄性0.43倍，雌性0.39倍）及球蛋白/白蛋轻微波动，恢复期后血液学参数正常。局部炎症为疫苗诱导的非不良反应性反应，无需额外耐受性研究。推荐成人两剂5×1010病毒颗粒（间隔4-6周），安全性风险可控且符合预期药理效应。

 

3.3遗传毒性和致癌性

         根据相关指南，未进行遗传毒性和致癌性研究。对于病毒疫苗，通常无需进行评估遗传毒性和致癌性的研究。由于该产品未使用佐剂或新型辅料，因此不开展这些研究是可以接受的。

 

3.4生殖毒性

         AZD1222的初步DART研究（490838^[9]）显示，小鼠妊娠期接种（EFD组：交配前13天+GD6；产仔组：GD6+GD15，剂量2.59×10¹⁰病毒颗粒）对母体生殖、胎儿存活及幼崽健康无不良影响，未发现内脏/骨骼异常或病理损伤，且抗S抗体可经胎盘（GD17.5）和乳汁（LD14）转移至后代。小鼠剂量为人类半剂量（5×1010病毒颗粒），但成分差异支持其合理性。数据与ChAdOx1 RVF疫苗（孕羊/山羊）结果一致，均无生殖毒性信号。

 

3.5局部耐受性

         未提交独立的局部耐受性研究报告。鉴于在重复剂量毒性研究中已对局部耐受性进行了评估，这是可以接受的，并且符合非临床疫苗研发的相关指南。

 

3.6生态毒性/环境风险评估

         AZD1222为单价疫苗，采用复制缺陷型黑猩腺病毒（ChAdOx1）载体编码SARS-CoV-2刺突蛋白，两次0.5mL剂量（5×1010病毒颗粒/剂，间隔4-12周）。基于复制缺陷特性、GMP生产及基因组稳定性（5次传代无变异），对人类和环境风险极低，无需监测病毒排出或意外暴露。废料按生物危害处理，溢出物需专用消毒，产品信息合规。

 

结语

         作为专注于临床前安全性评价的CRO服务提供者，我司具备全面的检测能力，涵盖体外毒性、免疫原性、生殖与发育毒性、生物分布及局部耐受性等关键环节，严格遵循GLP规范及ICH指南。依托先进的实验平台和资深毒理团队，我们致力于为新型疫苗（如mRNA、病毒载体、多价疫苗）的研发提供高效、可靠的安全性数据支持。

 

         随着疫苗技术向个性化与高效化发展，我们将持续优化评价体系，助力全球疫苗研发突破安全性与有效性的双重挑战。与您同行，为健康护航！

 

参考文献

[1] Volker Vetter, Gülhan Denizer, Leonard R. Friedland, Jyothsna Krishnan &
Marla Shapiro (2018) Understanding modern-day vaccines: what you need to know, Annals of Medicine, 50(2), 110-120
[2] David A. Montero, Roberto M. Vidal, Roberto M. Vidal. Two centuries of vaccination:historical and conceptual approach and future perspectives. Front. Public Health. (2023)11
[3] Delany I, Rappuoli R, De Gregorio E. Vaccines for the 21st century. EMBO Mol Med. 2014; 6:708–720.
[4] 预防用生物制品临床前安全性评价技术审评一般原则
[5] 预防用mRNA疫苗非临床研究技术指导原则
[6] 人用重组DNA制品药学研究与评价技术指导原则
[7] 预防用疫苗临床前研究技术指导原则
[8] 纳米药物非临床药代动力学研究技术指导原则
[9] European Medicines Agency. (2021). Assessment report: COVID-19 Vaccine AstraZeneca.
[10] Pedro M. Folegatti et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 2020; 396(10249), 467-478.

 

附录1

国内法规与指导原则

法规/指南名称	发布机构	发布年份	适用范围/重点内容
《药品注册管理办法》	国家药品监督管理局（NMPA）	2020	疫苗注册需提交非临床安全性数据，明确GLP合规要求。
《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）	NMPA	2017（修订）	规范非临床研究全流程（实验设计、执行、记录等），适用于疫苗安全性评价。
《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》	药品审评中心（CDE）	2005	明确毒理学、免疫原性、药效学及动物模型选择要求。
《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》	CDE	2021	针对基因治疗疫苗（如病毒载体疫苗）的非临床安全性评价特殊要求。
《疫苗生产流通管理规定》	NMPA	2023	非临床数据作为生产许可审查的必要依据。
《预防用疫苗药学研发可参考的技术标准》	CDE	2022	结合非临床数据评估疫苗生产工艺与质量。
《生物制品非临床安全性技术指导原则》	CDE	2018	涵盖疫苗在内的生物制品的长期毒性、免疫毒性、生殖毒性等评价要求。
《ICH S6(R1)（生物技术药物非临床安全性评价）》	NMPA转化实施	2012	生物制品（含疫苗）的种属选择、免疫原性评估等国际标准。
《ICH S8（免疫毒性研究）》	NMPA转化实施	2006	疫苗相关免疫毒性（如超敏反应、自身免疫）的研究要求。

 

附录2

国外法规与指导原则

法规/指南名称	发布机构	发布年份	适用范围/重点内容
WHO Guidelines on Nonclinical Evaluation of Vaccines	世界卫生组织（WHO）	2005	全球通用标准，涵盖单次/重复给药毒性、生殖毒性、局部耐受性等。
Guidance for Industry: Toxicity Grading Scale for Healthy Adult Volunteers	美国FDA	2007	疫苗临床试验前的非临床毒性分级标准。
EMA Guideline on Adjuvants in Vaccines	欧洲药品管理局（EMA）	2005	含佐剂疫苗的非临床评价（如佐剂毒性、免疫增强机制）。
EMA Guideline on Live Recombinant Viral Vectored Vaccines	EMA	2019	病毒载体疫苗的基因整合风险、载体扩散性等非临床安全性研究。
ICH S6(R1): Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals	国际人用药品注册技术协调会（ICH）	2011（修订）	疫苗的种属特异性、免疫原性、长期毒性等国际协调标准。
FDA Guidance: Development of Therapeutic Cancer Vaccines	美国FDA	2011	治疗性疫苗的非临床研究策略（如肿瘤模型选择）。
WHO Technical Report Series (TRS) No. 927	WHO	2005	疫苗非临床安全性评价的综合框架（包括替代动物模型应用）。
PMDA Guidelines for Non-Clinical Studies of Vaccines	日本药品医疗器械管理局（PMDA）	2010	日本国内疫苗的急性/亚急性毒性、生殖发育毒性评价要求。
Health Canada Guidelines for Vaccine Non-Clinical Evaluation	加拿大卫生部	2018	加拿大疫苗非临床研究的数据要求（包括新型佐剂评估）。
EMA Guideline on Non-Clinical Evaluation of mRNA Vaccines	EMA	2022（草案）	mRNA疫苗的特殊关注点（如脂质纳米颗粒毒性、外源性RNA稳定性）。