可防肾衰 | 糖尿病患者尿液的蛋白组学检测

一、背景介绍

目前全球糖尿病患者数量急剧上升，据报道有数亿人罹患该疾病，且呈现了儿童和青少年多发的不良趋势。糖尿病的长期高血糖状态会对全身多个器官系统造成损害，引发多种并发症，比如说糖尿病肾病，伴随着肾小球滤过率下降、蛋白尿等变化，直到肾脏滤过率极低，需要透析或移植时，即发展成为肾衰竭，产生严重后果。近年来研究表明，慢性低度炎症在糖尿病肾病的进展中扮演着核心角色，高血糖可激活多种炎症通路，招募炎症细胞，释放炎症因子，导致肾组织持续损伤和纤维化。因此，本课题基于尿液样本的补体蛋白组学研究，或有望更新糖尿病肾病机制认知，筛选潜在标志物和药物靶点，通过延缓或阻止进入肾衰竭，可显著降低医疗费用，改善患者生活质量与社会生产力。

 

二、材料方法

 

研究主要基于一项双队列研究，纳入了1型和2型糖尿病伴肾病的患者共304名，包含了长达10年的随访，以观察其发展为肾衰竭的变化；验证研究设置了一个三队列，旨在验证在双队列研究中的发现是否也适用于疾病早期；另外还包含了一个肾组织研究队列，进行蛋白质组比较、单细胞/单核RNA测序、空间转录分析，以探究尿液中补体蛋白来源和肾脏病理。研究利用尿液样本作为主要分析样本，用于测量补体蛋白水平；血浆样本用于与尿液结果进行比较，以评估循环系统中的补体蛋白水平；肾组织样本则用于蛋白质组学、单细胞/单核RNA测序和空转分析，以揭示肾脏器官内的分子变化和细胞定位。实验主要使用蛋白组学技术对尿液和血浆中的蛋白质进行定量分析，发现补体蛋白与肾衰竭关联；靶向检测则应用到早期至中期队列以验证关键蛋白；单细胞/单核RNA测序技术应用于肾组织样本，以确定表达关键补体基因的特定细胞类型；空转技术应用于组织切片以分析基因（如C2, C7）在肾脏不同区域的表达模式。相关数据分析主要为通路富集分析以识别与肾衰竭相关的蛋白，差异分析比较不同组别之间蛋白或基因表达，聚类分析划分不同亚群，相关性分析以计算尿液补体蛋白与临床指标（如eGFR）的相关性，生存分析用于评估蛋白水平与肾衰竭风险之间关联等，应用到了多重校正，无监督聚类等，相关机器学习模型包括了惩罚回归、决策树、弹性网络等。

 

三、结果讨论

研究基于晚期糖尿病肾病患者尿液样本的蛋白质组学检测数据，发现与肾衰竭风险显著相关的蛋白高度富集于补体系统，前5%最显著的补体蛋白水平与10年内肾衰竭风险呈强相关，其中 C2、C5a 等 6 种蛋白水平升高预示肾衰竭风险升高3-4倍，且该指标独立于其它临床指标成立；该关联在验证队列中得到证实，双方关联一致但效应递减。研究进一步揭示，这些补体蛋白在患者肾组织中表达升高，其编码基因主要在肾小球系膜细胞和足细胞中高表达，单细胞/空转分析进一步定位 C7 于纤维化成纤维细胞、CFH 于壁层上皮。

基于补体蛋白的聚类分析可识别出不同预后的患者亚群，多种机器学习模型也证实了补体蛋白组具有良好的肾衰竭预测能力，无监督聚类用 6 种蛋白可将患者分为高-中-低风险组，5 年肾衰竭率差异显著（T1D 78 % vs 13 %），表明其是跨越阶段的有效标志物。

 

四、研究结论

研究首次系统证实，尿液中补体蛋白（尤其是C2、C5a、CL-K1、C6、CFH、C7）是糖尿病肾病进展及肾衰竭的预测相关因子，其检测效应独立于传统指标。尿液样本具有无创、易获取，利用高通量蛋白组技术和特定蛋白检测即可实现早期风险分层、精准入组临床试验，并可直接指导补体靶向治疗，为降低全球DKD透析负担提供了可落地的生物标志物和干预新路径。

 

五、结果展开

图1. 课题研究框架示意图。

 

研究包括两个队列，纳入 189 例 1 型糖尿病（T1D）和 115 例 2 型糖尿病（T2D）合并晚期糖尿病肾病（DKD）患者，随访 10 年追踪糖尿病肾衰竭发生与否 。通过建立蛋白质组学数据与前瞻性肾脏结局之间的关联，详细分析蛋白质组学数据与糖尿病肾病进展的临床关系；并进一步在三个队列（共 652 例）中验证，随访早期至中期的 DKD 患者最长 5 年，评估上述关联是否同样适用于疾病早期阶段；研究还结合了尿液、血浆、肾组织三种生物样本的蛋白质组学分析，以及单细胞/单核 RNA 测序和空间转录测序，以探讨尿液补体蛋白升高的潜在来源。 

缩写：DKD，糖尿病肾病；T1D，1型糖尿病；T2D，2型糖尿病；GFR，基于肌酐估算的肾小球滤过率；AA，非裔美国人；sc/snRNAseq，单细胞/单核RNA测序。 

 

图2. 基于糖尿病肾病双队列研究数据的补体蛋白富集分析。

 

a. 使用DAVID基因功能分类工具进行的通路富集分析，显示了具有统计学意义的通路（P < 0.05）。

b. 使用Fisher精确检验进行的过表达分析，检测到补体蛋白的富集。图中十字标记代表中位数、第75百分位数和第25百分位数的值，P值均为双侧检验。

 

图3. 基于糖尿病肾病双队列研究数据显示尿液补体蛋白质组与肾衰竭风险的通路分析。

 

a. 基于高通量蛋白质组学检测的1305种蛋白质中，富集程度最高的通路（补体系统，共110种蛋白质）的全面视图。针状图展示了各蛋白与肾衰竭风险关联的强度，其数据来源于Cox比例风险模型，用于评估在双队列DKD晚期患者中10年内发生肾衰竭的风险。每根垂直针代表经对数转换（log10）的P值，该P值来自调整糖尿病类型的Cox模型（基础模型），每次分析一种经肌酐校正的补体蛋白。横轴上的蛋白质按通路、UniProt标识符（ID）及蛋白名称排序（部分蛋白共享同一ID，例如C5和C5a）。图中标注出最显著的前5% 补体蛋白，灰色线表示经Bonferroni校正后的显著性阈值（α = 4.5 × 10⁻⁴）。

b. 补体系统通路示意图，前5%最显著补体蛋白通路所对应的关联强度垂直条形图。在条形图和通路示意图中，最显著的补体蛋白以红色字体标出，所有P值均为双侧检验。

 

图4. 基于糖尿病肾病双队列研究数据分析补体蛋白质组与肾衰竭发生的关联、挖掘预后指标、以及对理解糖尿病肾病分子生物学基础。

 

a. 显示在两个队列中补体蛋白与 10 年肾衰竭发生风险的关联，分析基于Cox比例风险模型，已对糖尿病类型进行校正，效应量（实心菱形符号）及其对应的95%置信区间（水平条）表示尿液中经肌酐校正的补体蛋白每增加一个三分位数（tertile）所带来的风险变化。

b. 针状图显示尿液补体蛋白质组与临床传统指标的相关性，针的排列顺序与颜色遵循图3a中的通路注释，每根针的高度代表某一补体蛋白与针头标题所示临床传统指标之间的相关系数，P值为双侧检验。

c. 意大利面图展示在5种模型中，全部110种补体蛋白与10年肾衰竭风险关联的P值，黑色和灰色虚线分别表示经Bonferroni校正和名义显著性的阈值，P值为双侧检验。

d. 针状图显示尿液补体蛋白质组与分子肾脏损伤指标的相关性，针的排列顺序与颜色遵循图3a中的通路注释。

e. 弦图显示尿液补体蛋白质组与循环KRIS（肾脏风险炎症评分）之间关系，上方扇区代表与肾脏结局关联强度递减的KRIS中TNFRSF成员（绿色）和非TNFRSF成员（紫色），下方扇区显示依据补体蛋白与肾脏结局关联的强度排序。

 

图5. 基于糖尿病肾病双队列研究数据分析尿液补体蛋白与肾衰竭累积发生率的关系。

 

显示了患有糖尿病在10年随访期间发生肾衰竭的比例，数据基于经肌酐校正的尿液补体蛋白水平进行分组，a-f分别显示补体C2、C5a、肾集素1（CL-K1）、补体C6、补体因子H（CFH）及补体C7，实线为Kaplan-Meier生存曲线，周围阴影区域代表相应的95%置信区间，Log-rank 检验对三分位（T1、T2、T3）进行整体比较，所有 P 值为双侧检验，T1为下三分位，T2为中三分位，T3为上三分位。

 

图6. 依据糖尿病类型和肾脏疾病分期分析尿液补体蛋白与五个队列中肾脏疾病进展的关系。

 

a. 散点图显示在两个糖尿病肾病队列中，补体蛋白各自每增加一个三分位数时，与10年肾衰竭风险关联强度和效应量。补体蛋白以红色圆点标记，加权 Cohen’s kappa 系数（κw）及对应 P 值，用于检验 T1D 与 T2D 队列关联强度的一致性。

b. 显示在五个队列中进行的体蛋白与肾脏疾病关联分析，菱形为各队列效应估计，横线为 95 % 置信区间，尿液中补体蛋白每升高一个三分位数代表浓度增加。  

c. 显示补体蛋白与肾脏GFR 斜率变化关联性分析。

d. 显示补体蛋白与肾脏二分类复合变化关联性分析。

 

图7. 显示利用三种样本分析补体蛋白与糖尿病肾病进展的关联分析。

 

a. 双针图显示1型糖尿病合并晚期糖尿病肾病的队列中，尿液样本（左）与血浆样本（右）中补体蛋白与GFR相关性。

b. 火山图显示 DKD 组与对照组之间肾组织内补体蛋白表达水平对比。

c. 箱线图显示晚期糖尿病肾病组中，发生肾衰竭与未发生肾衰竭者，尿液样本（上）和血浆样本（下）补体蛋白相对浓度比较。

d. 箱线图显示晚期 DKD 组与对照组肾组织样本中补体蛋白表达对比分析。

 

图8. 肾组织样本单细胞/单核RNA测序以及空转测序分析相关补体基因的表达。

 

a. 相关基因总体表达水平及细胞占比分析。  

b. 气泡图显示DKD 组与对照组肾组织样本中相关补体基因表达的不同。

c. 空间转录数据分析补体 C2 与 C7 基因在DKD与对照肾组织中分布的不同。

 

图9. 显示补体蛋白无监督聚类分析与糖尿病肾病队列发生肾衰竭的关联分析。

 

a. Kaplan-Meier 曲线显示I型糖尿病肾病患者在5年随访期内发生肾衰竭情况。

b. 基于I型糖尿病数据的补体蛋白无监督层次聚类分析，聚类过程不考虑最终结局，彩色条带表示聚类分组及受试者后续是否发生肾衰竭。

c. 显示不同聚类分组I型糖尿病患者在5年内发生肾衰竭的比例。

d. Kaplan-Meier 曲线显示II型糖尿病肾病患者在5年随访期内发生肾衰竭情况。

e. 基于II型糖尿病数据的补体蛋白无监督层次聚类分析，聚类过程不考虑最终结局，彩色条带表示聚类分组及受试者后续是否发生肾衰竭。 

f. 显示不同聚类分组I型糖尿病患者在5年内发生肾衰竭的比例。

 

图10. 显示几种统计方法或机器学习模型预测肾衰竭能力对比。

 

模型缩写包括：Penalized-惩罚回归、Dec tree-决策树、Deep-深度学习、  LR-逻辑回归、PCA-主成分分析、EN-弹性网络、RD-岭回归、LS-套索回归、RF-随机森林、GBM-梯度提升机、NNET-神经网络。

 

参考文献：

Md Dom ZI, Moon S, Satake E, Hirohama D, Palmer ND, Lampert H, Ficociello LH, Abedini A, Fernandez K, Liang X, Pickett S, Levinsohn J, O'Neil K, Dillon ST, Mauer M, Galecki AT, Freedman BI, Susztak K, Doria A, Krolewski AS, Niewczas MA. Urinary Complement proteome strongly linked to diabetic kidney disease progression. Nat Commun. 2025 Aug 7;16(1):7291. doi: 10.1038/s41467-025-62101-5.