聚焦CRO｜特殊化合物血浆蛋白结合率测定：挑战与创新

          根据“游离药物假说”，只有游离药物能穿过细胞膜并与细胞内靶点相互作用，而蛋白结合型药物分子量过大，不能通过被动转运或细胞旁渗透穿过细胞膜。因此，血浆蛋白结合率（Plasma Protein Binding, PPB）直接影响药物的疗效、代谢与毒性。本文以酯前药瑞德西韦（RDV）为例，解析PPB测定的常规方法、特殊化合物的挑战及创新解决方案。

 

一、PPB测定的意义

          血浆中的药物通常以两种形式存在：游离态和血浆蛋白结合态。只有游离态药物能够穿过细胞膜，作用于靶点或参与代谢排泄。PPB直接影响药物的疗效、毒性和药代动力学（PK）特征。

 

其意义主要体现在以下几个方面：

1、指导剂量调整：对于肝肾功能不全、孕妇或新生儿等特殊人群，血浆蛋白水平可能显著降低，导致游离药物浓度升高，进而增加毒性风险。通过PPB数据，可优化给药方案，确保疗效与安全性。

2、预测药物相互作用：若两种药物竞争同一血浆蛋白结合位点（如白蛋白或α-1酸性糖蛋白），可能引发游离药物浓度的剧烈波动，造成严重的不良反应。PPB测定有助于评估此类相互作用的风险。

3、支持药代动力学建模：PPB是计算游离药物浓度、分布容积（Vd）和清除率（CL）的核心参数，对从体外实验到临床应用的转化至关重要。

4、满足监管要求：美国FDA和欧洲EMA均要求对高度蛋白结合（>80%-90%）的药物进行PPB研究，并建议在特殊人群中使用游离浓度进行PK分析。

 

二、常规PPB测定方法

          目前主流的PPB测定方法包括平衡透析（Equilibrium Dialysis, ED）、超滤（Ultrafiltration, UF）和超速离心法（Ultracentrifugation，UC）。每种方法各有优劣，需根据药物特性选择。

01 平衡透析（ED）

原理：半透膜（分子量截留约8-14 kDa）将血浆与缓冲液分隔，药物通过扩散达到平衡后，测定两侧浓度。

优点：公认的“金标准”， 聚四氟乙烯（Teflon）制造的试验装置降低了非特异性结合（NSB）的影响。

缺点：耗时较长（通常需要平衡4-8小时），不适用于不稳定化合物。

02 超滤（UF）

原理：采用半透膜分隔成两室，通过离心力将游离药物从血浆中分离至滤液中。

优点：快速（<1小时），显著减少药物的代谢，适合稳定性稍差的药物。

缺点：滤膜和管壁可能吸附药物，存在较强的非特异性吸附，需校正。

03 超速离心法（UC）

原理：通过超高速离心将蛋白质和蛋白质结合的药物沉淀下来，检测上清液的游离药物和初始药物浓度，进一步计算游离率。

优点：无膜吸附，非特异性吸附较低。

缺点：对设备要求较高；需要比较长的离心时间（2小时以上），不适用于不稳定化合物；超高速离心可能会破坏药物与蛋白质的结合。

 

 

三、特殊化合物的PPB测定挑战与策略

          酯前药是通过化学修饰提高稳定性的非活性形式，需代谢后释放活性成分，在血浆中极易降解，传统PPB方法难以准确测定。

          以瑞德西韦（RDV）为例：

          RDV在血浆中会被丁酰胆碱酯酶快速水解为中间代谢物，6小时内降解率高达71%。若直接采用ED法，药物可能在透析过程中完全降解，导致结果偏差。

    &nbsp;     针对以上情况，通过添加酯酶抑制剂抑制降解，同时验证其对稳定性影响和对蛋白结合的干扰。

01 添加酯酶抑制剂：

使用敌敌畏（Dichlorvos, DDVP）抑制丁酰胆碱酯酶活性。

02 方法验证

稳定性测试：添加0.5 mM DDVP后，RDV在37°C下24小时内降解<15%（图 1）。

结合率对比：比较ED（含DDVP）与UF（不含DDVP）的结果，发现两者无显著差异，证明DDVP不影响蛋白结合。

 

四、实际案例Compound 1的PPB测定

          Compound 1为酯前药，在SD大鼠血浆中，37°C孵育0.5小时即降解45.2%。即使使用超滤法进行PPB测定，也需要一定的时间预孵和离心，在这段时间中，化合物也会有较大程度的代谢，所以对该化合物也不适用。

          测试多种酯酶抑制剂，发现DDVP能够稳定Compound 1，对DDVP浓度进一步优化确定，68 μM/mL的DDVP能够使药物在4小时内降解率<10%。

    &nbsp;     在正式实验中，通过在阳性对照Warfarin的测定中加入同样浓度的DDVP，Warfarin的结合率在99.30%，与文献报道的数据一致。Compound 1在1 µM、3 µM和10 µM浓度下，SD大鼠的血浆结合率分别为97.80%、97.46%和97.52%，回收率分别为87.90%、93.39%和91.67%。

        &nbsp; 该案例表明，通过酶抑制策略可有效解决不稳定酯前药的PPB测定难题，为同类化合物的血浆蛋白结合率研究提供了创新方法支持。

 

五、结语

          血浆蛋白结合率（PPB）测定是药物研发的 “关键环节”。针对酯前药等特殊化合物的不稳定性，通过酶抑制策略（如DDVP阻断酯酶活性）成功突破测定瓶颈，这些实践经验为复杂药物的PPB研究奠定了方法论基础。随着不稳定前药及新型化合物开发的加速，未来亟需发展高灵敏、低干扰的检测技术，以应对更广泛的药物研发需求。

 

参考文献

1、Plasma Protein Binding Determination for Unstable Ester Prodrugs: Remdesivir and Tenofovir Alafenamide.