10分好刊 | 肝脏纤维化的空间代谢研究

一、背景介绍

         脂肪肝是一种以脂肪堆积为特征的肝脏疾病，其发病率随着饮食过量、肥胖增加等而迅速上升，比如说酒精过量摄取即可引发脂肪肝，其进展可以导致肝纤维化，纤维化是细胞损伤后胞外基质过度沉积导致，正常情况下肝纤维化是一个可逆的过程，但如果肝损伤持续存在，纤维化会逐渐加重，最终可能导致肝硬化、肝癌等严重疾病。脂肪肝与脂质代谢紊乱密切相关，研究脂质代谢在肝纤维化中的具体作用机制，有助于深入了解脂肪肝进展为肝纤维化的病理生理过程，早期识别和干预脂质代谢紊乱有助于阻止或逆转肝纤维化的发展，减少肝硬化的发生率。

 

二、材料方法

 

         肝硬化样本来自20名患者，涵盖了代谢功能障碍相关脂肪肝与酒精相关性脂肪肝，对照样本为32个正常肝组织，为验证发现还纳入了非肝硬化但确诊脂肪肝样本（24例）。动物实验包括了三种小鼠模型，分别为胆管结扎模型、慢性四氯化碳处理模型、西方饮食结合四氯化碳损伤模型。

 

         脂质组学分析基于LC-MS平台，将肝组织样本匀浆处理后以有机溶剂提取脂质，将脂质提取物进行液相色谱质谱分离检测，对脂质进行定性和定量分析，通过多元统计分析比较肝硬化和对照之间的脂质差异，筛选出差异脂质并分析其潜在作用。转录分析基于小鼠肝脏样本，分析差异表达基因及所涉及的代谢途径；成像质谱细胞术应用16种抗体对肝脏组织冷冻切片染色，分析不同细胞类型在纤维化和正常区的分布差异；空间代谢分析基于MALDI-MSI，对组织切片进行基质辅助激光解吸电离-质谱成像分析，对组织中的脂质分子进行检测，并生成脂质的空间分布图像，划分为纤维化区和正常肝实质区后，对这些区域的脂质代谢特征进行比较，筛选出在纤维化区域显著富集的脂质种类，并进一步分析其与肝纤维化的关系。

         药物干预实验应用到了LX-2肝细胞系和肝切片培养，相关抑制或刺激实验应用到了鞘脂代谢抑制药物，如N-乙酰-D-鞘氨醇等，或相关刺激因子如TGFβ-1等，通过Western blot等方法评估药物对肝星状细胞活化、纤维化的影响

 

三、结果讨论

         脂质组学分析结果显示，肝硬化样本中醚脂、饱和磷脂酰胆碱等脂质增加，而三酰甘油、二酰甘油等脂质减少，总鞘磷脂含量虽有所下降但某些类型，如SM（34:1）和SM（34:0），在肝硬化患者中却显著增加。进一步的空间代谢分析显示，这些脂质的分布存在空间异质性，在纤维化区域，醚脂、鞘脂等显著富集，而在正常区域磷脂酰胆碱等脂质更为丰富。小鼠模型脂质组学与空间代谢分析显示了相似的改变，基于小鼠的肝转录测序分析发现脂质代谢相关基因表达发生改变，与糖鞘脂代谢相关的基因表达上调。成像质谱细胞术与空间代谢相结合显示，与纤维化相关的脂质与细胞外基质标记物的空间分布高度相关。

 

         基于已有肝纤维化空间转录数据以及肝单细胞测序数据，发现肝纤维化中也存在脂质代谢相关基因表达的改变，许多脂质代谢相关基因在非实质细胞中广泛表达，如基质细胞等，表明不同细胞通过不同的脂质代谢途径参与肝纤维化。体外实验，不同浓度的鞘脂代谢途径抑制剂可降低αSMA蛋白的表达水平，能改变细胞内关键脂质的水平，可证实抑制鞘脂代谢对肝纤维化的抑制作用。

 

四、研究结论

         研究提供了对肝纤维化中脂质代谢改变的全面理解，揭示了鞘脂代谢途径在肝纤维化中的潜在作用，并通过抑制鞘脂代谢途径，观察到了抗纤维化效果，这表明鞘脂代谢途径可能是一个有潜力的抗纤维化治疗靶点。研究涉及了几种组学技术，尤其是通过空间代谢，研究能够在组织水平上观察到脂质分布的异质性，这对于理解肝纤维化的发病机制至关重要，研究发现不仅可以增进对肝纤维化病理生理学的认识，而且能够为开发新的抗纤维化治疗策略提供科学依据。

 

五、结果展开

图一.  显示患有脂肪性肝病（SLD）导致的肝硬化的患者肝脏具有显著不同的脂质特征。

         （A-B）通过液相色谱-质谱（LC-MS）测量并使用多变量分析比较了肝脏脂质谱。构建了正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型及其相关的S图，以对比SLD-肝硬化组（N=20）和对照组（N=32）。不同病因的肝硬化患者用不同颜色表示。
         （C）单变量分析和火山图揭示了各组之间的脂质特征存在显著差异。
         （D）显示在肝硬化样本中发生了丰度变化的几个脂类。数据（平均值±标准误差）通过Student's t检验进行分析：*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。SFA表示饱和脂肪酸；MUFA表示单不饱和脂肪酸。

 

图二.  显示脂肪肝中脂质代谢在空间发生了失调。

 

         （A）空间脂质组学显示了三种脂质的分布：蓝色表示PC(34:2)，洋红色表示PC(32:0)，黄色表示PC(32:1)，并附有相应的H&E染色组织切片（左）。
         （B）根据其质量谱特征将像素分类为肝纤维化或肝实质组织。
         （C）从8位不同的肝硬化患者中选择了6个感兴趣区域（ROIs），分别对应肝实质组织（N=24）和纤维化组织（N=24）。构建了OPLS-DA模型及其相关的S图，以比较实质组织与纤维化ROIs之间的脂质谱。
         （D）两种组织区域中富集的脂质类别。
         （E）显示了相邻的PSR染色切片以及SM(34:1)单离子强度图像。比例尺为500微米。
   ;      （F）PSR染色与SM(34:1)空间分布面积之间的Pearson相关系数。SL代表鞘脂类；LPL代表溶血磷脂类；PSR染色主要用于检测和评估组织切片中的胶原蛋白。

 

图三.  显示鼠肝纤维化模型中脂质代谢改变。

 

         （A）实验设计示意图。
         （B）通过液相色谱-质谱测量肝脏脂质谱并通过单变量分析进行比较，火山图显示纤维化组与对照组之间的脂质特征存在显著差异。
         （C）总己糖基神经酰胺（HexCer）和主要的鞘磷脂（SM）种类在纤维化过程中发生改变。数据（平均值±标准误差）使用Student's t检验进行分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
         （D）MALDI-MSI显示，在BDL、CCl4和WD+CCl4组中，相比各自的对照组，纤维化区域中的SM(34:1)增加，同时展示了相邻的PSR染色切片以及单离子强度图像。比例尺为500微米。

 

图四. 显示纤维化样本中编码脂质相关代谢酶的基因丰度发生了改变。

 

         （A）从鼠类纤维化模型的整体RNAseq数据中鉴别出的相对于各自对照组（每组N=5）差异表达的基因，以及在人类肝硬化中纤维化区域与实质肝脏区域之间差异表达的基因（此部分分析基于发表空间转录组学数据）。
         （B）涉及醚脂合成、磷脂重塑、神经酰胺和糖鞘脂代谢的代谢途径及关键基因。红色/蓝色标注的基因名称表示在人类肝硬化（纤维化对比实质组织）中显著上调/下调的表达；粗体名称表示在至少两个鼠类数据集中基因表达也以相同方向显著改变。PUFA表示多不饱和脂肪酸；DHAP表示二羟基丙酮磷酸。

 

图五. 显示编码脂质相关代谢酶的基因在不同细胞类型中具有特定表达模式。

 

         （A）分析了来自人类肝脏细胞图谱的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，以研究正常肝脏中不同细胞类型簇内关键脂质基因的表达情况。圆点的大小代表了细胞簇中含有可检测到的基因表达（计数>0）的细胞百分比，颜色深浅代表该簇内的平均表达水平。
         （B）均匀流形逼近与投影（UMAP）图突出显示了被注释为不同细胞类型的簇。
&nbsp;        （C）选定基因在各细胞类型中的表达情况，通过基因表达计数的颜色深浅来表示。对主要表达感兴趣基因的细胞类型进行了圈注。cDCs，传统树突状细胞；pCDs，浆细胞样树突状细胞；Mig. cDCs，迁移性传统树突状细胞；NK，自然杀伤细胞。

 

图六.  显示空间脂质组学与细胞标记物的成像质谱分析相结合的结果。

         （A）展示了来自肝细胞标记物的IMC染色代表性图像。
         （B）显示了在实质组织和纤维化区域中具有不同空间分布的关键脂质的单离子强度图像。这些图像有助于直观理解不同类型的细胞及其相关脂质在肝脏组织中的分布情况。
         （C）热图表示了脂质的空间分布与细胞标记物之间在6个不同的感兴趣区域（ROIs）和4位患者中的平均Matthews相关系数（MCC）。比例尺为100微米。

 

 

图七.  显示靶向抑制鞘脂代谢可以减少激活肝星状细胞（HSCs）和人肝切片（hPCLSs）中的纤维化反应。

 

         （A）展示了神经酰胺代谢途径及其抑制剂作用靶点的示意图。
         （B）LX-2细胞与TGFβ-1（2.5 ng/mL）以及神经酰胺代谢抑制剂或溶剂（Veh）共同处理72小时。通过Western blot分析（N=5-6）αSMA蛋白表达，显示了密度测定结果和代表性图像。
         （C）使用LC-MS（N=3）分析了经TGFβ-1激活并用抑制剂处理72小时的LX-2细胞的脂质谱。
   ;      （D）在hPCLSs中，通过ELISA测量经TGFβ-1（3 ng/mL）和PDGFββ（50 ng/mL）及神经酰胺代谢抑制剂或溶剂（Veh）处理96小时后的分泌型胶原蛋白1A1水平。

 

参考文献：

Gruevska A, Leslie J, Perpiñán E, Maude H, Collins AL, Johnson S, Evangelista L, Sabey E, French J, White S, Moir J, Robinson SM, Alrawashdeh W, Thakkar R, Forlano R, Manousou P, Goldin R, Carling D, Hoare M, Thursz M, Mann DA, Cebola I, Posma JM, Safinia N, Oakley F, Hall Z. Spatial lipidomics reveals sphingolipid metabolism as anti-fibrotic target in the liver. Metabolism. 2025 Jul;168:156237