10分好刊 | 干燥综合征中三级淋巴结构的多组学研究

一、背景介绍

         干燥综合征是一种以慢性炎症性外分泌腺病变为主要特征的自身免疫性疾病，主要表现为唾液腺和泪腺功能减退，导致口干和眼干，除了这些主要症状外，患者发生淋巴瘤的风险显著增加，大约5%会发展为淋巴瘤，研究发现，唾液腺中的淋巴细胞浸润和生发中心样结构的存在可能与淋巴瘤的发生有关，因此了解这些淋巴结构的变化对于预测和预防淋巴瘤的发生具有重要意义。基于单细胞与空间结构的多组学研究，能够提供关于淋巴结构中细胞类型、状态和相互作用的详细信息，可以发现与疾病进展相关的生物标志物和潜在的治疗靶点。例如，研究发现某些细胞亚群和信号通路在淋巴结构的成熟过程中起关键作用。

 

二、材料方法

         研究材料来自干燥综合征患者的唇部小唾液腺活检样本，动物模型样本由腺病毒感染诱导小鼠唾液腺形成三级淋巴结构（TLS），小唾液腺样本使用酶消化法制备单细胞悬液，流式细胞术去除死细胞，使用10x Genomics进行单细胞测序，每个样本10,000个细胞，测序深度为每个细胞50,000 reads起，测序后进行数据比对和定量，识别去除潜在的双细胞，进行数据归一化和聚类分析。

         多重免疫组化染色使用Opal™ Multiplex IHC方法对FFPE组织切片进行染色，流式细胞术使用CD36等抗体标记单细胞悬液，RNA原位杂交针对CCL19和CCL21等基因，对小唾液腺样本进行激光捕获显微切割，分离不同成熟阶段的TLS区域进行测序和分析。单细胞RNA测序数据进行聚类、差异表达、轨迹、基因集富集、配体-受体等分析，组织RNA测序数据进行差异表达、主成分分析，基于单细胞数据生成的签名矩阵，估计样本中细胞类型丰度；蛋白质组学数据分进行数据标准化和归一化后使用PCA分析。

 

三、结果讨论

         研究通过对干燥综合征患者的唇部小唾液腺活检样本进行单细胞RNA测序，鉴定出11个主要细胞簇，包括5个造血细胞簇和6个基质细胞簇，这些细胞簇涵盖了上皮/肌上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、壁细胞和少量神经细胞。在CD45-基质细胞簇中鉴定出多个亚群可能参与TLS的形成；成纤维细胞簇中显示出参与化学趋化因子梯度建立等特性；轨迹分析发现这些成纤维细胞亚群之间存在发育关系；壁细胞中表达某些趋化因子对于T细胞的募集和TLS的形成至关重要。

         通过比较单细胞数据发现患者样本中存在独特的基因表达特征，比如SjS样本中特异性表达CXCL13等，而Sicca样本特异性表达SCGB1D2等；体外实验发现SjS中的成纤维细胞在炎症细胞因子（如IFNγ）的作用下，能够上调CD40和VCAM-1的表达，显示出TLS微环境中的免疫细胞对成纤维细胞功能的影响。

         通过激光捕获显微切割分离了不同成熟阶段的唾液腺TLS区域并进行了 RNA测序，显示随着TLS成熟度的增加，炎症相关基因和蛋白的表达增加，显示出更强的炎症特征；蛋白质组数据与转录数据一致，表明TLS在成熟过程中富集了与炎症、细胞募集和共刺激相关的基因和蛋白。动物实验结果验证了LTβR信号通路在TLS形成中的重要性，通过比较野生型和LTβR敲除型小鼠，发现LTβR信号通路关键作用，缺乏LTβR信号会导致TLS形成受阻。

 

四、研究结论

         研究通过多组学技术的综合应用，深入揭示了干燥综合征中三级淋巴结构的形成和功能机制，为理解疾病病理提供了新的视角。这些发现不仅有助于开发针对TLS相关疾病的治疗策略，还为预测和预防淋巴瘤的发生提供了理论依据。多组学技术的应用为研究复杂疾病提供了强大的工具，有助于揭示疾病的分子基础，发现新的治疗靶点，并为个性化治疗提供支持。

 

五、结果展开

图1. 干燥综合征(SjS)患者小唾液腺的单细胞组学研究

 

         a. 小唾液腺(mSG)活检单细胞组学研究工作流程。
         b. 使用均匀流形逼近与投影(UMAP)对来自7位干燥综合征(SjS)患者的唾液腺样本中的17,011个单细胞进行降维和聚类分析，展示了免疫细胞和基质细胞的群集情况。
         c. 多重免疫荧光图像展示了从小唾液腺组织中识别的主要谱系，这些组织取自3名干燥综合征患者，并使用6重标记板进行探测：CD146（绿色）、VE-钙粘蛋白或CD20（黄色）、泛细胞角蛋白/CK（洋红色）、CD138（橙色）、以及CD68+ CD11c（青色）、CD45或CD8（白色）、Podoplanin/PDPN+CD90或CD3（红色）和CD4（蓝色）。比例尺= 50 µm。

 

图2. 干燥综合征(SjS)患者唾液腺中成纤维细胞和壁细胞亚群的单细胞数据分析。

 

         a. 在干燥综合征(SjS)小唾液腺(mSG)中，对成纤维细胞和壁细胞的转录组数据进行均匀流形逼近与投影(UMAP)降维及子聚类分析。
         b. 标识基因在成纤维细胞和壁细胞亚群中的表达情况。
         c. 用于空间识别唾液腺中免疫成纤维细胞和CCL21 CCL19周细胞的基因表达情况。  
         d. 多重免疫荧光图像展示了从小唾液腺组织（n=2）中鉴定出的免疫细胞和周细胞，CD138（绿色）、CD20或TNC（黄色）、泛细胞角蛋白/CK或CD82（橙色）、VE-钙粘蛋白（青色）、Podoplanin/PDPN（白色）、CD3或CD146（红色）以及DAPI或CD45（蓝色），比例尺= 20 µm。
         e. 来自两名患有干燥综合征(Sjögren’s syndrome)患者的唾液腺内免疫聚集区中CD146（灰色）周细胞与ccl21rna（绿色）、ccl19rna（红色）和DAPI（蓝色）的多重免疫荧光图像，比例尺= 20 µm。  
         f. 干燥综合征小唾液腺中CD146+ TNC+ CD36+ CCL21+ 周细胞群体的代表性流式细胞术鉴定。  
         ;g. 成纤维细胞和壁细胞群体的基因集富集分析（使用GO和Kegg基因集），展示了每个细胞亚群中前5个富集的基因集。

 

图3. 免疫成纤维细胞和CCL21 CCL19周细胞对信号通路表现出不同的依赖性。

 

         a. 成纤维细胞和壁细胞富集分析通路显示干扰素和TNF通路在免疫成纤维细胞和CCL21 CCL19周细胞中的富集情况，而NFκB通路仅在免疫成纤维细胞中富集。
         b. 小提琴图展示了与图a所示通路相关基因在成纤维细胞和壁细胞群中的表达情况。
         c. 多重免疫荧光图像展示了野生型（wt）和淋巴毒素β受体敲除（Ltbr–/–）小鼠TLS诱导的唾液腺中ccl21rna（绿色）、ccl19rna（红色）血管表达、DAPI（蓝色）和CD45+（黄色）免疫聚集区的情况。Ltbr–/–导致TLS消失，并减少了免疫聚集区内CCL19的表达。
         d. 对野生型（wt）和Ltbr–/–小鼠TLS诱导的唾液腺进行流式细胞术分析，以检测CCL21+CD34+免疫成纤维细胞和CCL21+CD146+周细胞，确认免疫成纤维细胞对LTβR信号的依赖性以及CCL21 CCL19周细胞的独立性。
         e. 根据SCENIC推导的调控子活性对细胞类型进行聚类，显示出成纤维细胞和壁细胞谱系的明显区分。
         f. 热图展示了前15个按活性排序的调控子在成纤维细胞CCL19 TNFSF13B和周细胞CCL21 CCL19群中的调控子活性。

 

图4. 显示干燥综合征(Sjogren’s syndrome, SjS)和口干症(Sicca syndrome)之间信号通路在关键群体中有所区别

 

         a. 火山图展示的干燥综合征(SjS)与口干症样本之间检测到的差异表达基因。
         b. 干燥综合征或口干症亚群中与信号通路及三级淋巴结构形成相关的基因表达情况。
         c. 在干燥综合征(SjS)与口干症的免疫成纤维细胞或CCL21 CCL19周细胞单细胞群之间检测到的选择性差异表达基因。
         d. 对干燥综合征和口干症活检全组织RNA提取物中的IFNG、CXCL9、CCL21、CD40、CXL13、CCL19、TNFSF13B mRNA转录本进行qPCR分析。

 

图5. 干燥综合征(Sjogren’s syndrome)患者小唾液腺显微切割区域的量RNA测序及与对照扁桃体组织的比较。

 

         a. 显微切割样本批量测序的主成分分析(PCA)图。
         b. 在显微切割样本测序数据中三级淋巴器官发生相关重要基因表达情况。
         c. Nanostring Geomx蛋白表达数据的PCA图。
         d. 在Nanostring Geomx数据中，对三级淋巴器官发生相关的重要蛋白表达情况。
         e. 使用单细胞测序数据作为参考图谱，通过Cibersortx推断出批量测序样本中的细胞亚群比例。

 

图6. 显示基于单细胞空间蛋白质组学数据解析的TLS（三级淋巴结构）发育过程中细胞和结构解析。

 

         a. 唾液腺的多重免疫荧光图像显示了免疫细胞聚集的发展过程，比例尺=50 µm。
         b. 单细胞蛋白质表型的UMAP图。
         c. 细胞邻域热图。
         d. 三级淋巴结构（TLS）的空间邻域图。
         e. 邻域1（富含CXCR5+B细胞和免疫成纤维细胞）的丰度随发育阶段的变化。
         ;f. 唾液腺多重免疫荧光图像，显示在免疫聚集发展过程中的关键细胞亚群，比例尺=20 µm。

 

参考文献：

Nayar S, Turner JD, Asam S, Fennell E, Pugh M, Colafrancesco S, Berardicurti O, Smith CG, Flint J, Teodosio A, Iannizzotto V, Gardner DH, van Roon J, Korsunsky I, Howdle D; Roche Fibroblast Network Consortium; Frei AP, Lassen KG, Bowman SJ, Ng WF, Croft AP, Filer A, Fisher BA, Buckley CD, Barone F. Molecular and spatial analysis of tertiary lymphoid structures in Sjogren's syndrome. Nat Commun. 2025 Jan 2;16(1):5.