Microbiome (IF>14) | 40例EBI婴儿的宏基因组学研究

一、背景介绍

         肠外细菌感染（EBIs）可发生于低月份婴儿（小于 60 天），见于多个非肠道位置，包括泌尿道、菌血症或败血症、脑膜炎等，不同部位感染可能会有不同的临床表现，但发热通常是共同的症状之一。目前EBIs的临床诊断依赖于细菌培养，需 24 - 48小时之后确定具体病原体，且待测样本易受抗生素应用的干扰，故临床症状和实验室检测虽可辅助判断，但仍缺乏特异性标志物用于快速诊断。已有研究表明，引起 EBIs 的细菌常存在于婴儿肠道中，肠道微生物菌落可能是病原体的栖息地，因此基于低月份发热婴儿粪便样本的宏基因组研究，可以明确肠道微生物组与 EBI 之间的关系，筛选高风险病原体针对性预防及诊疗。

 

二、材料方法

 

         研究队列包含了40个婴儿（小于60天），已确诊患有肠外细菌感染，其中70%为尿路感染，其余为菌血症、脑膜炎等，另有74个婴儿作为对照。肠道样本主要为粪便，另有部分直肠拭子，采集后即存-80°C备用，按照研究目，一部分样本用于病原体的选择性培养与鉴定，一部分样本用于宏基因组学研究。

 

         病原体培养筛选基于之前临床信息，病原体分型采用MALDI-TOF-MS技术，以多位点序列分型（MLST）进行详细基因分型，并对培养筛选后的菌株开展全基因组测序；宏基因组学研究优先使用粪便样本，但初步测序结果显示粪便样本和直肠拭子样本之间的微生物群落组成相似，故两者均用于后续分析，DNA提取使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒，测序平台为Illumina NextSeq或NovaSeq，宏基因组数据分析包含了物种分类、多样性、菌株水平、毒力因子、微生物与感染状态关联分析等，进一步的统计分析均在R Studio中进行，目的为寻找差异，关联标志物与感染状态，相关方法包含了Shapiro-Wilk检验、Wilcoxon秩和检验、Spearman相关和线性回归等。

 

三、结果讨论

         研究表明了肠道菌群与EBI婴儿病原体类型的关联性，多样性分析发现EBI样本具有较低的α多样性，比如物种丰富度、Shannon多样性指数均下降，表明疾病发生与肠道菌落多样性减少存在关联，致病菌筛选鉴定发现大肠杆菌为主要致病菌之一，在多个样本中均检测到了该类型菌株，数据分析表明肠道中该菌型与肠外感染部位分离出菌型，两者共享99.5%的全基因组平均核苷酸同一性（ANI），充分表明这两种来源的菌株为同一类型，表明肠道可能是某些病原体进入血液循环并引发全身性感染的重要来源之一。

 

         对于毒力因子的分析显示，宏基因组数据中可以检测到一些毒力因子，但实验组和对照组之间并未发现显著统计差异，表明毒力因子或许不是关联的主要因素。菌株水平分析结果显示，某些特定序列类型STs在病例组中更为常见，比如大肠杆菌ST69和ST131，在患儿肠道样本的宏基因组数据中显著升高，且与特定类型的肠外细菌感染（如尿路感染）密切相关，提示这些STs或与较高的感染风险相关联。基于相关数据的分析，揭示了肠道菌群、特定病原及菌株水平特征，证实了肠道与EBI致病菌来源的关联，为进一步诊疗策略奠定了相应基础。

 

四、研究结论

         研究验证了肠道某些病原体进入血液并引发EBI感染的推想，挖掘出特定序列类型（STs）与感染风险的关联，观察到多样性降低与感染发生的相关性。通过宏基因组测序技术、MLST和FastANI等数据挖掘方法，课题不仅揭示了EBI婴儿肠道菌群与感染之间的关系，为进一步开发基于微生物组的诊疗策略奠定基础，而且显示出数据挖掘的强大作用，确保了临床研究结果的科学性和实用性，对于未来改进临床实践具有重要意义

 

五、结果展开

图1. 显示肠外感染细菌和肠道分离细菌之间基因组相关性

a. 条形图显示肠外感染细菌株是否在肠道中存在，即是否培养出相同类型和序列类型（ST）的菌株。
b. 直方图显示通过成对比较计算的大肠杆菌全基因组单核苷酸多态性（SNP）数量的分布情况。
c. 直方图显示通过成对比较计算的其他致病菌全基因组单核苷酸多态性（SNP）数量的分布情况，包括粪肠球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和变形杆菌。

 

图2. 显示宏基因组读数映射描绘 EBI 样本中肠道病原体的高丰度定植情况。

a. 显示宏基因组读长映射到EBI相关病原体的基因组覆盖广度（过滤条件为≥0.5以便于可视化）和群体平均核苷酸同一性（popANI）。
b. 显示通过培养和/或inStrain方法确定存在于肠道中的致病菌株相对丰度与其归一化覆盖度的比较（颜色表示具体来源）。

 

图3. 显示患有大肠杆菌 EBI 的婴儿，其肠道微生物组的组成差异与年龄和感染情况相关

a. 显示通过物种丰富度衡量的 α 多样性，对比所有 EBI 病例婴儿和对照婴儿肠道宏基因组的物种丰富度，P 值通过 Wilcoxon 秩和检验确定。
b. 显示通过香农多样性（Shannon diversity）衡量的 α 多样性，对比 EBI 病例婴儿和对照婴儿肠道宏基因组的香农多样性，P 值也是通过 Wilcoxon 秩和检验确定。
c. 显示基于物种水平计算样本间 Bray-Curtis 相异度的主坐标分析（PCoA）图。PCoA 轴括号内显示的是其解释的变异百分比。x 轴和 y 轴边缘的箱线图分别对应 PCoA 轴 1 和轴 2 的值。 
d. 显示通过广义线性混合效应模型挖掘大肠杆菌相对丰度与大肠杆菌 EBI 状态之间的关联，并与对照婴儿进行比较。 
e. 显示患有大肠杆菌感染的EBI婴儿和对照婴儿的大肠杆菌相对丰度随日龄变化的线性回归。

 

图4. 显示经过肌酐浓度校正后，精氨酸作为肠杆菌感染样本诊断标志物的潜能。

a. 显示大肠杆菌参考基因组进化分支图，条形图展示了在肠道中有筛选到匹配菌株的大肠杆菌 EBI 病例（匹配组）、未鉴定出匹配菌株的大肠杆菌 EBI 病例（非匹配组）以及对照婴儿中每种参考基因组被识别出的频率。
b. 显示不同组之间大肠杆菌系统发育群B2的相对丰度，分组方式与A相同。 
c. 显示广义线性混合效应模型所鉴定出毒力因子（VF）基因的对照比较情况。

 

参考文献：

DeVeaux AL, Hall-Moore C, Shaikh N, Wallace M, Burnham CD, Schnadower D, Kuppermann N, Mahajan P, Ramilo O, Tarr PI, Dantas G, Schwartz DJ. Metagenomic signatures of extraintestinal bacterial infection in the febrile term infant gut microbiome. Microbiome. 2025 Mar 24;13(1):82