药学CMC视角｜如何揭开N-亚硝基地平类亚硝胺杂质的谎言面纱

近年来药物中亚硝胺杂质（如NDMA）的安全性问题，监管机构要求对药物中亚硝胺类杂质（NDSRIs）的形成和毒性进行评估。二氢吡啶类CCBs因其结构中含仲胺基团，理论上可能形成N-亚硝基杂质，但此前研究未能明确其形成机制。而市面上不断充斥着各种所谓的“N-亚硝基地平”的杂质标准品。这类假冒的“N-亚硝基地平”对药企和药物研发机构带来不断的伤害，并且产生的污名化效应对于很多杂质标准品企业也是一种损害。今天为大家带来的是一篇高水平学术期刊文献，是对于二氢吡啶类钙通道阻滞剂的亚硝基衍生物合成的系统性研究。

 

常见的二氢吡啶类CCBs，可以根据苯环取代基的不同分为三类：

• 硝基取代型：如硝苯地平（nifedipine）、尼索地平（nisoldipine）、尼莫地平（nimodipine）。
• 氯取代型：如非洛地平（felodipine）、氯维地平（clevidipine）。
• 其他取代型：如拉西地平（lacidipine）

 

而对于仲胺形成N-亚硝基化合物的机制主要是基于两个方面：

 

1）亚硝酸盐在弱酸性条件下，亚硝酸通过脱水形成氮氧化物，直接作用仲胺形成N-亚硝基化合物；

2）亚硝酸盐在强酸性条件下，亚硝酸被质子化形成亚硝基正离子，作用于仲胺后形成N-亚硝基化合物。风险评估的方案就是通过模拟上述两种亚硝化机制，来判断目标化合物有无生成亚硝化杂质的风险。为了进一步补充风险评估的依据，还可以加入了亚硝酸叔丁酯（TBN）作为亚硝化试剂，该实验是最强亚硝化条件，作为评估方案来使用。

 

亚硝化风险评估的一般方案

参考EFPIA 指南，EFPIA workflows for Quality Risk management Jun 2024 v03：

• 方案一：将化合物（1.0eq.）分散/溶解于醋酸水溶液（30%，V/V），其中底物浓度设定为0.1M。然后加入亚硝化试剂，亚硝化试剂为亚硝酸钠（1.5eq.）。在密闭反应容器中，室温下反应24小时。取样，用高分辨质谱对目标化合物离子流提取分析。
• 方案二：将化合物（1.0eq.）分散/溶解于稀盐酸水溶液（pH=3-4），其中底物浓度设定为0.1M。然后加入亚硝化试剂，亚硝化试剂为亚硝酸钠（1.5eq.）。在密闭反应容器中，室温下反应24小时。取样，用高分辨质谱对目标化合物离子流提取分析。
• 方案三：将化合物（1.0eq.）溶解于能够溶解目标化合物的有机溶剂（THF、ACN、DCM等）。其中底物浓度为0.1M。然后加入亚硝化试剂，亚硝化试剂为亚硝酸叔丁酯（1.5eq.）。在密闭反应容器中，室温下反应24小时。取样，用高分辨质谱对目标化合物离子流提取分析。

 

对于六种常见二氢吡啶类CCBs进行亚硝化风险评估并对产物进行分析如下：

• 硝苯地平（Nifedipine）：在条件1和条件3下，硝苯地平表现出高反应活性，主要发生分子内消除和氧化芳构化，生成C-亚硝基产物和硝基苯基吡啶衍生物。其高反应性归因于邻位硝基的吸电子效应。未检测到N-亚硝基产物，表明亚硝化发生在碳原子上。

• 非洛地平（Felodipine）：在条件3下，非洛地平生成C-亚硝基产物，产率为11%。通过NMR和X射线晶体学确认其结构为甲基碳上的亚硝化产物。首次分离并表征了C-亚硝基非洛地平，排除了N-亚硝基杂质的可能性。

• 其他化合物（尼索地平、尼莫地平、氯维地平、拉西地平）：在条件1和条件2下，主要生成氧化芳构化产物（吡啶类似物）；在条件3下，除芳构化产物外，还生成少量C-亚硝基产物。C-亚硝基产物的产率顺序为非洛地平（11%）> 氯维地平（9%）> 拉西地平（8%）> 尼莫地平（3%）> 尼索地平（≤1%）。这一顺序与苯环取代基的电子效应和空间位阻相关。

 

小结：

本研究证实二氢吡啶类CCBs在亚硝化条件下主要生成C-亚硝基产物，而非N-亚硝基杂质。这一发现为药物中亚硝胺杂质的风险评估提供了重要依据。监管机构可基于此研究结果，制定更合理的二氢吡啶类药物的亚硝胺限量标准（如非洛地平的AI限值为1500 ng/day）。但是仍需进一步研究C-亚硝基产物的毒性和稳定性，以完善药物安全评估体系。

 

参考文献：

1、Synthesis of Nitroso Derivatives of Dihydropyridine Calcium Channel Blockers. //doi.org/10.1021/acs.oprd.5c00153

         作者：周宜轩