药学CMC视角｜吐温降解危及抗体药？高分辨质谱精准锁定元凶

• 吐温20/80是抗体药物制剂中常用的表面活性剂，守护着蛋白质的稳定。然而，它们本质上是高度复杂的酯类混合物，易发生降解。降解不仅削弱其保护作用，导致蛋白稳定性降低，更会带来不溶性微粒析出的风险，严重威胁药品安全。
• 传统方法难以应对吐温的复杂性和微量降解物。高分辨质谱（HRMS）凭借超高分辨率和精确质量数，可对吐温组分进行表征，精准捕捉痕量降解产物，成为破解难题的利器。

图1. 吐温结构示意图

 

通过分析吐温 80 的合成过程，可以从理论上推测其可能含有的组分。生产上吐温80是用山梨醇酐与油酸及约 20 摩尔的环氧乙烷反应而制得。吐温80的合成包含三步反应：山梨醇脱水（位点差异形成复杂混合物）、油酸酯化（位点复杂性加剧）和环氧乙烷聚合。原料与工艺的差异导致其化学组分和比例高度异质化，最终吐温80的化学组分及比例可能存在很大差异。

 

一、运用高分辨质谱对吐温中组分进行表征，拆解吐温“黑匣子”

图2. 吐温总离子流图（TIC）示例

 

图中黑色方格中为吐温组分单甘油酯，双甘油酯、三甘油酯；红色方格中为降解产物，以其中单甘油酯组分运用高分辨质谱对其进行解析。

图3. 单甘油酯组分HRMS解析示例

 

从RT5.150min的MS图可以看出从650Da~1000Da有一组低质荷比信息，1250Da~1700Da之间有一组高质荷比信息；其中低质荷比部分为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯加合2个Na+形成的双电荷结构；高质荷比部分为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯加合1个Na+形成的结构。以其中m/z1331.8263[M+Na]+离子峰为例，其为聚氧乙烯20脱水山梨醇单油酸酯加合1个Na+形成的的结构（理论m/z1331.8273[M+Na]+，相差0.7ppm)，推测结构见下图。以此进行其他离子峰推断，该色谱峰为聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯（PSM）（POE单元数为19-36）。

图4. 聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯（PSM）（POE单元数为19-36）

 

二、运用高分辨质谱对吐温中降解产物进行表征，捕捉隐形威胁

图5. 降解产物HRMS解析示例

对RT0.518处峰进行离子流提取，从MS图可以看出从500Da~1200Da之间有两组质荷比信息（589.3135、633.3397、677.3660......为第一组，每组分子量差44；609.3106、653.3366、697.3627.....为第二组，每组分子量差44）；其中以第一组分子量中m/z765.4179为例，其为聚氧乙烯30山梨醇酐加合2个Na+形成的双电荷结构，其结构分子量为m/z1507.8466[M+Na]+（理论m/z1507.8441[M+Na]+，相差1.6ppm），推测结构见下图。因此RT0.518峰可推断其为PI聚氧乙烯山梨醇(POE单元数为22-36)。

图6. 聚氧乙烯山梨醇(POE单元数为22-36)

 

另外在吐温样品中还识别到氧化产物及其特征离子的存在，这是由于油酸酯容易在不饱和双键未知氧化形成各种氧化产物。

 

小结：

抗体药物制剂中吐温会发生降解，进而产生不溶性微粒的风险，其中HCP（宿主细胞蛋白）酯酶水解和氧化降解是吐温的主要降解途径。

 

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参考文献：

[1] Li X , Wang Z , Zheng B ,et al.Novel Strategy to Rapidly Profile and Identify Oxidized Species of Polysorbate 80 Using Ultra-High-Performance Liquid Chromatography Coupled with High-Resolution Mass Spectrometry[J].Analytical chemistry, 2023(24):95.