文献解读 | 单细胞代谢组学研究迈进现实

一、背景介绍

代谢研究已经成为解码生命过程与疾病机制的有效策略，但传统的样本分析只能反映代谢物的整体均值，这掩盖了细胞间异质性这一关键事实，随着精准医学理念渐渐普及，研究者迫切需要单细胞级别分析。质谱成像(MSI)技术是进行单细胞级别检测的希望，其无需破碎样品，一次扫描即可在组织切片上同时获得数千个代谢物的空间分布图，为肿瘤边缘界定、药物分布追踪等场景提供直观证据，当前 MSI 平台已能在 5-10 µm 像素下实现高通量采集，是开展空间代谢研究的有利工具，不过在面向单细胞时，目前 MSI 仍然具有短板，比如激光与基质多针对脂质优化，导致氨基酸等分子信号被淹没等。因此相关科研领域急需一种既能实现全面检出小分子代谢物，又能高通量分析样品的单细胞代谢物检测平台，而近期《Cell》所发表的论文，正是为了试图解决这一痛点，有望让单细胞小分子代谢组成为可重复、可扩展、可落地的常规工具。

 

二、材料方法

研究推出了名为HT SpaceM 的单细胞代谢物检测方案，其结合了“激光蚀刻标记-开展质谱成像-进行数据云注释-代谢物与细胞解卷积”这一整体设计，可以将数十个样本加载于同一载波片，单次实验可完成超过 10 万细胞的代谢谱采集。研究采用负离子模式结合 1,5-二氨基萘(DAN)基质，靶向 100–400 m/z 区域，可实现 100–200 种内源小分子代谢物的稳健检出，其中 54% 离子经 LC-MS/MS 验证，涵盖了氨基酸、核苷酸、有机酸与脂肪酸等七大类；研究开展多个玻片之间验证实验，对细胞孔、细胞类型之间进行数据对比分析，检测代谢物变异性，以进行质控与重复性分析；研究解析了 HeLa 与 NIH3T3 共培养模型，以研究单细胞分辨率可靠性，对 NCI-60 等肿瘤系进行细胞图谱无监督聚类，以挖掘瘤种特异性代谢标志物；为验证平台的动态检测能力，研究以 2-DG 糖酵解抑制模型分析葡萄糖-中心协同网络和与细胞周期相关的内源异质性，为药物机制研究提供新视角；研究开发了相关分析代码与脚本可参见GitHub。

 

三、结果讨论

研究结果显示，HT SpaceM 在 72 孔（3 玻片）实验中检出 135–202个 [M-H]⁻离子，单细胞平均 30–80 离子；54 % 分子式经 bulk LC-MS/MS 一级验证，涵盖氨基酸、核苷酸等七大类。载玻片细胞孔间 Pearson R ≥ 0.97 的代谢物占 76 %，载波片之间 ≥ 0.97 代谢物占 61 %，81 % 离子变异CV ≤ 20 %。共培养分型随机森林 F1 = 0.81 ，准确率 80 %。NCI-60 9 系 + HeLa 总计 42 153 细胞，UMAP 按细胞系聚类，发现 70个标志代谢物，其中 29 种 bulk 未检出；ORA 显示 NCI-H460 脂肪酸通路富集，BT-549 Warburg 效应相关通路上调。共丰度网络跨 10 系，谷氨酰胺-谷氨酸、葡萄糖-柠檬酸为保守枢纽。2-DG 处理 HeLa 15 697 细胞，葡萄糖节点连接数随时间增加，聚类得到与细胞周期相关的两大亚群，5 重复稳定出现。

平台一次可分析 40 样本/玻片，总细胞数 78 500–140 000，检测通量比原 SpaceM 提升 5 倍；激光蚀刻定位使图像-质谱亚像素对齐，分割时间缩短 70 %；相关数据和代码已上传 BioStudies S-BSST2127 与 GitHub HT-SpaceM。

 

四、研究结论

研究首次实现单一载玻片加载 40 样本、>10 万细胞、135–202 种小分子代谢物的稳健检出，重现性达到常规代谢检测水平；相关细胞系检测结果挖掘出 70个标志物，2-DG 干预实验揭示了动态监测能力，为肿瘤分型和药物机制研究提供新工具；相关代码开源让单细胞代谢研究实现标准化。不过该平台目前尚未实现悬浮细胞、组织切片样本的兼容，且MSI本身存在异构体辨别问题等，有望在进一步研究中完善。

 

五、结果展开

图1. 显示HT SpaceM 实验流程与数据的分析框架。

A. 在玻片上用激光蚀刻定位标记与编号，并制作安装可拆卸的孔池用以培养细胞。

B. 将细胞接种于孔室内，待贴壁后，进行固定染色后冲洗备用。

C. 首先对玻片进行显微拍照，接着进行MALDI质谱成像分析，然后再次进行显微拍照，以记录激光烧蚀痕迹。

D. 利用定位标记把显微小图拼接成大图，对齐质谱成像前与成像后的图谱，采用人机交互方式圈选 MALDI 采集区域，将所获得质谱数据上传至 METASPACE 进行代谢物注释，然后使用优化好的 Cellpose 把像素里的代谢物信号批量分配到单细胞。

E. 单细胞数据分析框架涵盖数据质量控制、无监督特征描述、重现性评估、变异度量化、结构验证、差异分析与网络分析。

 

图2. 显示HT SpaceM 可以检测多通路多类别的内源小分子代谢物。

A. 利用HeLa 细胞开展相关实验，显示明场与Hoechst蓝色荧光成像结果，可见细胞与胞核轮廓，借助 Cellpose 可获取分割效果、细胞与激光标记叠加效果，以及单细胞解卷积后的代谢物强度效果(图中以伪彩色直观呈现出N-乙酰天冬氨酸在细胞间的分布差异)，比例尺 100 μm。

B. 图中x轴显示细胞孔编号，y轴为每个孔里检出的[M-H]−离子总数(FDR ≤ 10%)，表示实验结果质控与稳定性。

C. 显示利用HeLa细胞(66.2%)与 NIH3T3细胞(33.8%)所获单细胞代谢谱的覆盖度。

D. 显示利用 iPath3 绘制的人源主要代谢 KEGG 图谱，检测到的内源代谢物作为节点按类别着色，连线代表代谢反应。

E和F. 分别显示检出代谢物类别与代谢通路的柱状图。

G. 韦恩图显示 HT SpaceM(负离子模式)与 LC-MS/MS(正、负离子模式)所检测到的物质异同。

 

图 3. 显示利用HT SpaceM 检测 72 个细胞孔所获取代谢物数据，其重复性与变异性与 LC-MS/MS 检测方法相当。

A. 用皮尔逊相关系数(R)和拟合斜率，对同一张玻片内孔与孔之间的离子强度(经TIC对数转换)进行重现性评估。

B. 来自不同玻片的同一细胞系(HeLa 或 NIH3T3)重复孔之间皮尔逊 R 值的分布。

C. 玻片内与片间的同一细胞系(HeLa 或 NIH3T3)重复孔之间皮尔逊 R 值的分布。

D. 皮尔逊R值显示玻片间的重现性。

E. 显示各代谢物在非零细胞中(即该细胞中相应代谢物检测值大于零)的平均强度与其变异系数。

F. 显示基于两个细胞系所有检出的离子中变异系数最小的代谢物。

G. 按类别显示 HeLa 与 NIH3T3 两细胞系中代谢物变异系数分布。

H. 基于所有检出代谢物(n = 135)的 HeLa 和 NIH3T3 单细胞 UMAP 图，按细胞系着色(左)或按 Leiden 聚类结果着色(右)。

I. UMAP分析类似图 (H)，按玻片重复样本着色。

J. 基于细胞系HeLa vs NIH3T3 的 MA 图，横轴为平均离子强度，纵轴为两细胞系对比所得FC，其中差异代谢物以浅蓝(HeLa 高)或深蓝(NIH3T3 高)标出。

K. 显示按照差异代谢物(已进行了TIC 归一化)的强度进行分析的 UMAP图。

L. 显示HT SpaceM 检测与 LC-MS/MS 验证数据中一级或二级代谢物的变异系数。

M. 显示基于LC-MS/MS 验证数据中 CV≤20% 的 59 种离子所作 UMAP图，仍可清晰区分两细胞系。

N. 显示HT SpaceM(点图)中差异代谢物，与 LC-MS/MS(热图)中的表达趋势对比。

 

图4. 显示单细胞代谢谱可准确预测细胞类型。

A. 显示NCI-H460 与 NIH3T3 共培养后的复合图像(明场+荧光)，NIH3T3 自带 GFP 信号(λ=509 nm，绿色)，细胞核用 Hoechst 染色(λ=461 nm，蓝色)，以 GFP 强度作为细胞类型标注依据，比例尺 100 μm。

B. 显示各重复孔中 GFP 强度呈双峰分布，用于设定分型阈值。

C. 显示基于代谢谱的随机森林分类结果(准确率 0.80，F1 得分 0.81)，右侧 UMAP 对比预测标签与真实标签；顶部为最具判别力的代谢标志物。

D. 标志物(NCI-H460 的 FA 18:1 与 NIH3T3 的 GPI)在 UMAP 上的空间分布及归一化强度小提琴图，显示两群细胞代谢差异显著。

 

图 5. NCI-60 细胞系与 HeLa 细胞系的单细胞代谢特征。  

A. 显示各细胞系每细胞检出离子数分布。

B. 显示基于 202 种离子的 42,153 个单细胞代谢谱 UMAP，包括NCI-60 39,575 个，HeLa 2,578 个，按细胞系着色。

C. UMAP图类 B，但按照 Leiden 无监督聚类着色。

D. UMAP图类 B，但按肿瘤的组织来源着色。

E. 显示各细胞系标志性代谢物的平均强度(特征缩放)及阳性细胞占比。

F. 针对每个细胞系进行的代谢物类别(基于HMDB数据库)富集分析。

G. 针对每个细胞系进行的代谢通路富集分析(基于小分子通路数据库)。

 

图6. 显示单细胞代谢物共丰度网络分析。

A. 显示各细胞系中共检出且共丰度的离子对分布。

B. 显示跨细胞系最保守的共丰度离子对。 

C. 显示各细胞系代谢网络中的枢纽代谢物，按PageRank节点中心性排名。  

D. 各细胞系单细胞共丰度网络图，节点为代谢物(按类别着色)，边为 Pearson R。

E. 热图展示每细胞系按代谢物类别计算的节点平均连接度。

 

图7. 显示HT SpaceM可动态检测糖酵解抑制后出现的代谢协同与细胞间异质性。

A. 显示2-脱氧-D-葡萄糖作用机制，其通过积累 2-DG-磷酸阻断糖酵解前两步而发挥作用。

B. 显示对照组(n = 8,185)、2-DG处理12小时(n = 4,479)和2-DG处理24小时(n = 3,033)条件下HeLa细胞的UMAP图。

C. 显示代谢标志物的变化，包括葡萄糖积聚、糖酵解中间体(FBP、GA3P)下降、柠檬酸上升，其信号强度已经 TIC 归一化处理。  

D.以葡萄糖为中心的共丰度网络显示实验组代谢协同被重塑，节点为代谢物类别，边为 Pearson R。

E. 显示葡萄糖与代表性代谢物(N-乙酰天冬氨酸、谷氨酰胺)的单细胞相关性变化，强度已经 TIC 归一化并对数转换处理。

F. 显示按处理条件着色的 UMAP 及每重复中各聚类细胞占比柱状图。

G. 聚类在空间上的分布及代谢物强度(经TIC归一化处理)映射，显示异质性并非技术偏差。

H. 各条件独立聚类分析仍然可以重现类似F数据占比，提示亚群状态在处理前后均保守存在。

I. 聚类间差异代谢物 MA 图，标志物暗示两群细胞可能处于不同细胞周期阶段。

 

参考文献：

Delafiori J, Shahraz M, Eisenbarth A, Hilsenstein V, Drotleff B, Bailoni A, Wadie B, Ekelöf M, Mattausch A, Alexandrov T. HT SpaceM: A high-throughput and reproducible method for small-molecule single-cell metabolomics. Cell. 2025 Sep 2:S0092-8674(25)00929-8. doi: 10.1016/j.cell.2025.08.015.