体外新视界｜不仅仅是“无菌”，支原体与分枝杆菌的快速检测新技术与应用

在细胞治疗产品的生产与质控中，“无菌”只是一个起点。支原体与分枝杆菌作为两类难以培养、却可能严重影响产品安全性与有效性的微生物，常常成为质量体系中的“隐形威胁”。传统培养法虽可靠，但周期长（支原体培养需28天，分枝杆菌培养甚至更长），无法满足细胞治疗产品快速放行的需求。如何实现既快速又可靠的检测，已成为行业亟待突破的瓶颈。

本文将围绕中国药典 (ChP)、欧洲药典 (EP) 与美国药典 (USP)  的相关要求，结合ICH Q2指导原则，系统梳理支原体与分枝杆菌的快速检测新技术，并深入探讨其方法开发、验证与合规应用策略，助力企业建立高效、合规的微生物安全控制体系。

 

一、支原体与分枝杆菌检测为何关键？

支原体：无细胞壁，可通过滤膜，易在细胞培养中潜伏繁殖，影响细胞生长、代谢和功能，甚至干扰实验数据与产品效力。

分枝杆菌：生长缓慢、耐受性强，尤其是非结核分枝杆菌（NTM），在液体培养基、缓冲液等环境中可能长期存活，一旦污染难以清除。

法规明确要求：

• ChP〈3301〉支原体检查法与〈0234〉生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制对支原体及分枝杆菌传统培养方法有详细规定。USP 〈63〉 Mycoplasma Tests 与 EP 2.6.7 MYCOPLASMAS同样将支原体检测列为必检项。

• 对于快速方法，需遵循ChP〈9201〉药品微生物检验替代方法验证指导原则、USP 〈1223〉Validation of Alternative Microbiological Methods 与 EP 5.1.6 ALTERNATIVE METHODS FOR CONTROL OF MICROBIOLOGICAL QUALITY进行方法验证，证明其不低于药典方法的灵敏度与特异性。

 

二、快速检测新技术全景解读

1、核酸扩增法（NAT）——主流快速路径

• qPCR / ddPCR：针对支原体保守序列（如16S rRNA基因）或分枝杆菌特异性基因（如IS6110、hsp65），实现数小时内高灵敏度、高特异性检测，同时光谱检测多种支原体/分枝杆菌。

• 等温扩增技术：如环介导等温扩增（LAMP），无需热循环仪，更适合现场或快速筛查。

• 多重PCR Panel：可同时检测多种支原体或分枝杆菌，覆盖更全的风险谱。

2、酶联免疫与荧光染色法

• 基于特异性抗体或核酸荧光探针，实现快速可视化初筛，常作为培养法的补充或过程监控工具。

3、代谢活性检测法

通过检测微生物代谢产物（如ATP生物发光法）间接反映污染，适用于环境与中间品的过程监测。

4、微流控与芯片技术

整合样品前处理、扩增与检测于一体，朝向“样本进、结果出”的全自动快速平台发展。

 

三、方法学验证：快速技术合规应用的基石

无论采用何种快速方法，都必须进行系统的方法学验证，核心验证参数包括：

• 专属性/特异性：确保不与非目标微生物或样本基质交叉反应。

• 灵敏度：使用国际标准菌株（如M. pneumoniae、M. phlei）确认检测下限。

• 精密度与耐用性：评估重复性、中间精密度及操作变量影响。

• 可比性研究：与药典培养法进行并行测试，证明快速方法等效或更优。

特别对于支原体快速检测，需要根据申报地药典要求覆盖所有指示菌株，并包括样本干扰试验。

 

四、在细胞治疗产品流程中的整合应用策略

检测环节	推荐技术组合
细胞库（MCB/WCB）	qPCR/ddPCR 快速筛查 + 药典培养法确认
生产过程中控	快速核酸法或代谢活性法高频监测
终产品放行	经过验证的快速qPCR法（覆盖高风险物种），实现数小时内出具结果，支持快速放行。

 

五、从“无菌”到“精准防控”，提速不降标

支原体与分枝杆菌的快速检测，不仅是技术的升级，更是质量控制理念的进化——从被动的“培养等待”转向主动的“实时监控”。通过整合快速核酸技术、严谨的方法学验证与全流程风险控制策略，企业可在不牺牲安全性的前提下，大幅缩短检测周期，加速产品研发与上市进程。

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