体外新视界丨从冻存到复苏：细胞产品稳定性研究的关键指标与方案设计

一、引言

细胞治疗产品的稳定性贯穿储存与运输全程，涉及细胞活力、功能及遗传特性的完整保留。中国药典2025版首次将“稳定性”纳入细胞检定基本要求，ICH Q5C也为生物制品稳定性提供纲领。冻存复苏过程易造成损伤，科学设计稳定性研究是确保产品质量一致性的关键。

 

二、法规框架

2.1 国际协调指南体系

ICH Q5C作为生物制品稳定性研究的纲领性文件，明确了稳定性数据的生成与提交要求，核心原则包括稳定性研究应覆盖储存、运输和使用全阶段，以及效价/生物学活性是关键的稳定性指示指标适用于细胞治疗产品。鉴于细胞的“活”性本质，稳定性研究的设计需在此基础上进行延伸和深化，重点关注细胞在冷冻应激下的功能恢复与遗传稳定性。

2.2 CDE指导原则

针对细胞治疗产品的特殊性，国家药监局药品审评中心（CDE）发布的《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》提供了更具操作性的指导。该原则明确要求：稳定性研究需验证冷冻贮存的细胞成品、起始细胞或中间样品在冻存和复苏条件下的质量变化，包括细胞数量、活率、外观完整性、功能等；如适用，还应验证多次冻融的影响。

2.3 中国药典2025版关键更新

2025年版中国药典三部通则0234新增“稳定性”检查项，明确将稳定性分为生产稳定性和贮存稳定性两个维度：

生产稳定性：评估主细胞库（MCB）/工作细胞库（WCB）与生产终末细胞（EOPC）或生产限定代次细胞（LIVCA）之间产品产量和特性的一致性。对于重组细胞，需评估插入基因序列、插入位点、目的蛋白序列及翻译后修饰的一致性；对于二倍体细胞，需确保细胞的二倍性。

贮存稳定性：可通过生产中细胞复苏时的活力数据评估。若长时间未生产，应按一定时间间隔对贮存细胞的活力进行测定。药典明确规定：冻存后复苏细胞的活率一般应不低于80%，若低于80%应进行充分评估并有验证数据支持。

 

三、冻存阶段的关键指标与风险管控

3.1 冻存时应选择处于对数生长期、活力≥95%的细胞进行冻存，冻存密度应经过优化，冻存前细胞应进行微生物安全检查。

3.2 冷冻保护剂是细胞冻存成功的核心要素，目前主流方案主要包括DMSO为基础的方案、DMSO-羟乙基淀粉（HES）联合方案、无DMSO替代方案。

3.3 冻存工艺中的降温速度和储存温度条件是关键参数。

冻存稳定性监测：对于长期储存的细胞库，应制定定期复苏验证计划。建议至少每年从MCB和WCB中随机抽取样本进行复苏检测。

 

四、复苏阶段的关键指标与过程控制

4.1 复苏是冻存过程的逆操作，其核心原则是快速解冻、缓慢稀释、温和洗涤。

4.2 复苏后关键质量属性检测

检测类别	具体指标
理化特性	外观、颜色、澄清度、pH、渗透压
细胞特性	细胞总数、活率、目的细胞比例、细胞表型
功能活性	生物学活性/效价（如杀伤活性、分化潜能）
安全性	无菌、支原体、内毒素
遗传稳定性	STR分析、核型分析（如适用）

4.3 反复冻融影响研究

细胞治疗产品在使用过程中可能面临多次冻融（如分次输注、运输温度波动）。CDE指导原则明确要求验证多次反复冻融的影响。 

 

五、稳定性研究方案设计

5.1 研究阶段与批次要求

根据ICH Q5C和CDE指导原则，细胞产品稳定性研究应覆盖以下阶段：

IND阶段：提供覆盖临床试验周期的实时稳定性数据，可阶段性提交。

上市阶段：至少3批代表性产品的长期稳定性数据（自体产品可用健康供者细胞替代）。

5.2 稳定性研究条件设计

长期试验：模拟拟定储存条件（如液氮气相-150°C，或-80°C超低温冷冻），在拟定有效期时间点进行检测。

加速试验：可进行挑战试验，如将细胞置于-80°C（而非液氮）储存一定时间，评估温度波动风险。

运输稳定性：模拟运输过程中的最差条件，包括：高温、震荡、方向变化等。

5.3 数据分析与有效期确定

稳定性数据分析应遵循ICH Q1A(R2)的统计原则，采用单边95%置信区间法确定有效期。对于细胞产品，由于批间差异可能较大，建议采用合并批次分析或批次间差异评估策略。

产品有效期的接受标准需要基于临床批次的效价范围和产品自身特性来制定，并与药政部门达成共识。

 

六、特殊考量：不同类型细胞产品的稳定性策略

干细胞（MSC、iPSC）：维持未分化状态，检测多能性标志物、分化潜能、免疫调节功能及遗传稳定性。

免疫细胞（CAR-T、NK、TIL等）：保持效应功能，检测CAR表达、细胞因子分泌、杀伤活性和表型亚群。

基因修饰细胞：确保转基因稳定表达，检测拷贝数、表达水平、插入位点及复制型病毒。

 

七、构建全生命周期稳定性管理体系

从冻存到复苏的稳定性研究，是细胞治疗产品质量控制的"最后一公里"。随着2025版中国药典对细胞基质稳定性要求的提升，以及全球监管趋严，企业必须建立覆盖细胞库构建、生产工艺、储存运输、临床使用的全生命周期稳定性管理体系。
华测医药建议采取以下整合策略：

早期介入：在细胞库构建阶段即启动稳定性研究，建立MCB/WCB的基准数据；

风险导向：基于细胞类型和产品特性，识别关键质量属性和关键工艺参数；

方法验证：确保所有稳定性指示方法（尤其是效价检测）经过充分验证，具备足够的精密度和灵敏度；

持续改进：通过年度质量回顾，对稳定性数据进行长期趋势分析，建立产品质量档案，及时发现潜在的漂移风险并启动纠正与预防措施（CAPA）。

通过系统性的研究设计和严格的执行，华测医药能够为"活的药物"建立从实验室到临床的可靠桥梁，确保每一剂细胞产品都保持其应有的安全性和有效性。

 

参考文献

1.ICH Q5C. Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products. International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. 1995.

2.ICH Q1A(R2). Stability Testing of New Drug Substances and Products. International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. 2003.

3.ICH Q1E. Evaluation for stability data Q1E. International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. 2003.

4.国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2025年版）三部. 通则0234 生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制.

5.国家药品监督管理局药品审评中心. 免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）. 2022.

6.国家药品监督管理局药品审评中心. 生物制品稳定性研究技术指导原则（试行）. 2015.

7.Allwood M, Wilkinson AS. Assessing shelf life of injectable biologicals in ready-to-administer containers. European Journal of Hospital Pharmacy. 2013;20(3):146-150.

8.Katkov II. Is stem cell chromosomes stability affected by cryopreservation conditions? Cryobiology. 2008;57(3):220-222.

9.United States Pharmacopeia. General Chapter <1046> Cell and Gene Therapy Products. USP-NF 2023.

10.Clapisson G, Salzmann JL, Pili J, et al. Cryopreservation with hydroxyethylstarch improves cell recovery in chronic lymphocytic leukemia. Cryobiology. 2004;48(3):295-301.