药学CMC视角丨质谱技术助力司美格鲁肽未知杂质鉴定——多肽药物杂质研究实战案例分享

司美格鲁肽（Semaglutide）作为长效GLP-1受体激动剂，在2型糖尿病和肥胖症治疗中地位举足轻重。随着原研药专利临近到期，国内外药企纷纷布局其仿制药，研发竞争日趋白热化。然而，多肽药物的结构复杂性远超传统小分子，一个氨基酸的差异、一个侧链修饰的偏移、甚至一个手性中心的改变，都可能影响药效或引发免疫原性风险。因此，对未知杂质进行精准结构鉴定，成为决定项目成败的关键环节。

近半年来，华测医药完成了多个司美格鲁肽相关项目的杂质研究，积累了从主峰纯度筛查到痕量杂质结构解析的完整实战经验。本文将结合代表性案例，梳理研究思路，并展示质谱技术在多肽杂质鉴定中的核心价值。

 

一、研究思路：层层递进的“三步法”

面对未知杂质，ag真人平台官方遵循一套成熟的技术路径：

01色谱分离与富集

针对原有关物质方法（常含不挥发性磷酸盐）不兼容质谱的问题，采用二维液相（2D-LC）在线脱盐或离线富集，确保目标杂质以纯净形式进入质谱。

02一级质谱精准定质量

高分辨Q-TOF测定精确分子量，计算元素组成，初步判断杂质类型（缺失/插入/修饰/聚合等）。

03二级质谱碎片解析

通过碰撞诱导解离获得b/y离子系列，结合软件进行序列匹配，定位修饰位点或确认序列变异。必要时采用还原烷基化处理含二硫键的样品。

 

二、典型实战案例

案例1：主峰纯度研究，排除共洗脱风险

目的：确认司美格鲁肽片剂样品主峰中是否隐藏其他分子量杂质

该片剂有关物质方法使用磷酸盐流动相，无法直接进质谱。ag真人平台官方通过二维液相，在主峰前、中、后三个位置分别切割，在线脱盐后进行Q-TOF分析。三批样品共9个切峰位点，实测母离子[M+H]⁺均与司美格鲁肽理论值匹配（偏差＜15 ppm），各电荷态分布清晰，未发现其他分子量信号，即主峰内无共洗脱杂质，为制剂质量控制提供了关键数据支撑。

 

案例2：注射液降解杂质，精准锁定修饰位点

目的：对司美格鲁肽注射液中某个未知降解杂质进行结构鉴定

采用二维液相富集该杂质峰，进行MS及MS/MS分析。一级质谱去卷积后精确分子量与司美格鲁肽理论值存在微小差异，提示发生了化学修饰。二级质谱产生丰富的b/y碎片离子，经软件匹配，发现N端氨基酸残基的碎片离子呈现特征性质量偏移，结合其二级碎片谱图规律，最终推断该修饰源于N端组氨酸残基的环化反应。环化反应是多肽药物储存过程中较为常见的一类降解途径，该杂质的结构确证为处方工艺优化提供了明确靶点。

 

图1. 司美格鲁肽注射液紫外吸收典型图

 

案例3：注射液中多个杂质同时筛查

目的：对司美格鲁肽注射液液相图谱中所有可见杂质峰进行分子量测定

 

图2. 司美格鲁肽注射液样品加速试验供试品溶液色谱图

 

ag真人平台官方采用一维富集+二维质谱的方式，对自研制剂及参比制剂中的20余个杂质峰逐一采集一级质谱，计算[M+H]⁺精确质量。上图为样品加速试验条件下的有关物质色谱图，各编号峰均纳入质谱筛查范围，部分代表性结果如下：

 

品名	杂志峰	实测[M+H]⁺	备注
1	杂质峰A	4128.1306	+16 Da（可能氧化）
2	杂质峰B	3975.0794	缺失片段
3	杂质峰C	3890.0266	缺失较大片段
4	杂质峰D	8332.1830	可能二聚体

通过分子量信息，ag真人平台官方可快速判断哪些峰可能为工艺相关杂质（如缺失肽）、哪些为降解产物（如氧化、脱酰胺），为后续针对性结构解析和限度制定奠定了基础。

此外，华测医药完成了司美格鲁肽四肽羧酸及活化物中间体中多个未知杂质的分子量确认，为合成工艺优化提供了数据支持。

 

三、多肽药物研究检测服务体系

依托华测医药先进的质谱平台（Agilent 6530/6545 Q-TOF，二维/在线脱盐系统），ag真人平台官方提供覆盖多肽药物全生命周期的分析服务：

结构确证：完整分子量、氨基酸序列（自上而下/自下而上）、二硫键定位、翻译后修饰（脂肪酸酰化、环化等）位点确认。

杂质谱研究：工艺杂质与降解杂质的分离、结构鉴定及来源追溯。

方法开发与验证：针对不兼容质谱的方法进行2D-LC-MS改造，建立合规的检查方法。

稳定性研究：加速及长期试验中降解杂质的动态监测与结构确证。

 

多肽杂质研究，难点在于结构相似、修饰多样、浓度极低。高分辨串联质谱正是解开这些结构谜题的金钥匙。实战经验证明：只要色谱分离得当、质谱参数优化合理，绝大多数未知杂质都能被“读”出序列和修饰信息。

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