文献共享 | 代谢组学/宏基因组技术分析慢性肾脏疾病中肠道菌群的特异性特征

慢性肾脏疾病(CKD)是一种巨大的医疗负担，通常与代谢和心血管并存有关。许多危险因素，包括年龄、性别、遗传、接触重金属、吸烟、过量饮酒、病毒感染、肥胖、高血压和糖尿病，已经被证明是相互关联的，并且对估计CKD的预后和影响其进展为终末期肾病(ESRD)是必要的。如此复杂的病因增加了疾病的临床异质性，并促使识别CKD的可操作的易感因素，以阻止疾病进展到终末期肾病(ESRD)。

 

01 背景介绍

慢性肾脏疾病(CKD)是一个严重的医疗困境，与肠道微生物区系和循环代谢组的特殊变化有关。在CKD微生物群中，与次级胆汁酸生物合成相关的微生物基因在早期差异丰富，而与脂代谢和脂多糖生物合成相关的途径模块在CKD微生物群中富集。越来越多的证据表明CKD和ESRD与肠道的微生物组成和功能有关。虽然不确定，但与正常对照组相比，终末期肾病患者的成分发生了改变，表现为菲米米特、放线杆菌和变形杆菌显著丰富，而双歧杆菌和乳杆菌的丰度减少。在ESRD患者中，ag真人平台官方观察到与正常对照组相比，ESRD患者的成分发生了明显的变化，富含Firmicut、放线杆菌和变形杆菌，而双歧杆菌和乳杆菌的丰度则减少了。值得注意的是，菌群对肠道环境变化的不适应可以在这种综合征的早期阶段被检测到。这种肠道生物失调，再加上肠道屏障功能受损，通过调节细菌易位和循环中内毒素和其他有毒管腔产物的存在，决定了CKD的整体炎症状态。

尽管基于16S rRNA的测序已经在医学微生物学方面取得了重大进展，但宏基因组测序被认为比16S rRNA基因测序提供了更深入的分类学特征和对人类微生物群的功能洞察力。到目前为止，肠道微生物群对慢性肾脏病的研究主要集中在疾病的晚期或早期肾功能下降。并有针对性地对具有不同严重程度和非CKD对照的CKD患者队列中的血清胆汁酸、SCFA(<6个碳原子)、中链脂肪酸(MCFA，碳原子)和尿毒症毒素(PC和IS)进行分析，将肠道微生物群信息与循环宿主-微生物共代谢物数据联系起来。ag真人平台官方的多组学分析揭示了几个与循环代谢物和疾病严重程度密切相关的非生物基因/途径和物种水平分支，这可能具有病因学和诊断意义。

 

02 采集方法

采用队列研究和样本采集相结合的方法

根据NKF/DOQI分类，CKD被定义为在两个不同的预约中存在蛋白尿或估计的肾小球滤过率(EGFR，通过简化的肾脏疾病方程中的饮食修改来确定)小于60ml/min/1.73m²，并被划分为1-5期，共采集72例CKD患者样本，将患者分为三个阶段

早期(1期和2期，n=26)；

中期(3期，n=26)；

晚期(4期和5期，n=20)。

1、此外，还招募了20名肾功能正常且年龄、性别、糖尿病和高血压状况相匹配的受试者进行比较。

2、在样本采集前7天内，受试者不允许服用任何补充剂或含有益生菌的食物，如酸奶。

3、每名受试者禁食8h后抽取全血5mL，室温凝血30min，1500×g离心10min。将所得上清液等分保存在-80°C直到使用。

4、采集粪便标本10g，置于核酸防腐剂中，于采集后24~48h内送至本研究中心，置于-80°C保存至粪便DNA提取。

03 宏基因组测序

1、使用粪便FastDNA Spin Kit（MP Biomedical）分离粪便DNA；

2、并使用Covaris M220超声仪(Covaris，Inc.)进行破碎；

3、根据说明使用TruSeq DNA样品制备试剂盒(Illumina)进行文库制备，在Illumina HiSeq仪器上产生每个样品至少6GB的150bp的数据。

 

宏基因组测序的数据处理及分析

通过使用BowTie222对照参考基因组(Hg19)映射序列来丢弃宿主序列。剩下的一组干净的读数被汇集在一起，并使用megaHit进行宏基因组分析，以创建重叠群。使用BowTie2将干净的读取映射到重叠群，映射输出用于通过MetaBAT进行重叠群分组，使用MetaGeneMark从组装的重叠群中预测基因，所有的非冗余基因在去复制后被用来构建基因目录。通过使用BWA MEM将读数与基因目录进行比对，并测量映射到每个基因序列的读数，来确定每个样本中的基因丰度。为了构建物种水平的分类图谱，根据分配给物种的读数除以样品中比对的总读数，计算每个样本中物种的相对丰度。功能注释是通过使用GhostKOALA将注释的ORF映射到京都基因和基因组百科全书(KEGG)蛋白质数据库来执行的，GhostKOALA用于标记具有KEGG同源(KO)编号的非冗余基因。将来自同一KO的基因的相对丰度相加，作为样本中该KO的含量，生成KO谱。

 

04 靶向代谢组学研究

对SCFA和MCFA进行靶向分析，从Sigma购买了11种标准品（丙酸、丁酸、戊酸、癸酸、己酸、癸酸、异丁酸、异戊酸、庚酸、乙酸和辛酸）。将含10%硫酸(SIGMA)和20 mg/L 2-甲基戊酸(Dr.Ehrenstorfer GmbH)的250μL内标溶液加入150μL的血清样品中。样品旋转30s，然后振荡10min，10000 rpm离心，4°C离心15min，在-20°C放置30min，然后将有机层转移到玻璃瓶中进行GC-MS分析。采用Agilent 7890B-5977B质谱仪进行检测分析。

同时对血清样本也进行了UHPLC-MS/MS分析，使用

Agilent 1290 Infinity II，Waters ACQUITY UPLC BEH仪器进行分析。以及使用Thermo Fisher Q Exactive Focus质谱仪进行质谱分析。采用平行反应监测(PRM)法进行定量分析。为了获得所有的校准曲线，如果信噪比(S/N)小于20或校准精度不在80-120%内，则将测量排除在校准之外。用信噪比(S/N)确定检测下限(LLOD)和定量下限(LLOQ)。LLOD和LLOQ被定义为可提供信噪比分别为3和10的最低分析物浓度。

 

05 统计分析

临床指标间差异采用t-test检验或Kruskal-Wallis检验，分别用Wilcoxon置和t检验法比较了基于各样本间的多样性。用Wilcoxon置和检验评价不同升高或耗竭的肠道微生物和血清代谢物。用Spearman等级相关法评价微生物与宿主代谢物的关联性，并用Benjamini-Hochberg法校正其重要性。采用效应大小的线性判别分析(LDA)，采用非参数析因Kruskal-Wallis检验、Wilcoxon秩和检验和LDA来识别两个元数据类别之间差异丰富的生物标志物。根据各个KO组的Z分数计算出5条代谢途径(碳水化合物代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢、多糖生物合成和代谢以及其他次生代谢物的生物合成)的差异富集KEGG模块。报告分数Z>1.5(按正态分布>90%置信度)的模块被认为是显著的生物失调模块。

对于每项测试，通过PROC使用五次交叉验证构建的接收器操作特征(ROC)曲线来检验模型的性能。以相同的方法进行排序、确定最佳特征数以及测试肠道细菌和血清代谢标记物组合的性能。除非另有说明，否则所有的统计检验都是双尾的，p<0.05被认为具有统计学意义。

 

06 结果与讨论

项目研究设计及项目特点

为了探讨CKD患者肠道微生物与宿主循环代谢物的关系，ag真人平台官方从92名受试者的横断面队列中收集了粪便DNA和血清样本，其中72例患者(26例轻度、26例中度和20例晚期CKD)和20例非CKD对照分别进行了宏基因组测序和靶向代谢组学分析。由于特异性肠道生物失调与15号糖尿病和高血压有关，ag真人平台官方招募了慢性肾脏病患者中最常见的两种合并症，即肾功能正常、年龄、性别和糖尿病和高血压状况相匹配的非慢性肾脏病对照组(见下表)，以排除潜在的混杂因素。血清尿素氮、血肌酐和表皮生长因子受体水平反映了各组之间的疾病严重程度。

 

 

不同病情的慢性肾脏病的元基因组和代谢组学特征

全面摸索与CKD进展相关的肠道微生物群，使用ag真人平台官方的内部处理粪便样本的测序序列数据，执行质量控制检查、过滤和宏基因组测序。ag真人平台官方首先比较了不同组别的肠道微生物多样性。随着疾病的严重程度，样本内物种丰富度(α多样性)呈下降趋势，因为晚期慢性肾脏病组的物种丰富度显著低于非慢性肾脏病对照组。相反，ag真人平台官方在慢性肾脏病微生物群中观察到更高的样本间差异(β多样性)，表明不同慢性肾脏病组之间的群落结构比对照组更异构。为了剖析详细的分类学特征，ag真人平台官方进行了严重特定的比较，其中每个CKD严重程度组与非CKD对照组进行了比较，并根据213个物种水平分支的丰度进行了左旋肝病的比较。总体而言，在至少一个慢性肾病严重程度组中，分别有7种和6种物种表现出显著的减少和上升(p<0.0 1)。

 

 

检测宿主-微生物共代谢物中CKD严重程度的特殊变化，ag真人平台官方对11种饱和脂肪酸、胆汁酸和两种尿毒症溶质(IS和PC)进行了有针对性的代谢谱分析。与非慢性肾脏病对照组相比，至少有一个慢性肾脏病严重程度组的4种脂肪酸(癸酸、己酸、丙酸和庚酸)显著降低(P<0.0 1)，2种肾毒素(IS和PC)在晚期显著升高。己酸和PC水平分别与肾小球滤过率呈正相关和负相关。此外，在慢性肾脏病的晚期，注意到两种胆汁酸(甘氨酸脱氧胆酸和甘鹅脱氧胆酸)和三种附加脂肪酸(戊酸、乙酸和辛酸)的轻微消耗。

 

 

肠道微生物种类与循环宿主-微生物共代谢产物的相关性

检测特定的肠道微生物是否负责与CKD进展过程中受到扰动的微生物和代谢物的丰度之间的关系，对213个物种与循环代谢物的大规模关联发现进行了评估。ag真人平台官方确定了一组与PC水平呈正相关的物种，其中许多始终被针对eGFR的LEfSe或Random Forests回归模型选择为生物标志物，表明此类物种的潜在参与 CKD发病机制中的相关性。

 

 

多组学特征区分慢性肾脏病与非慢性肾脏病对照

测试肠道代谢组和血清代谢组学参数作为诊断标志物的潜力，ag真人平台官方构建了仅基于物种、代谢物的随机回归模型或两者的组合，以区分不严重程度的慢性肾脏病对照病例。三种模型之间的分类潜力的比较显示，组合模型在区分三个慢性肾脏病严重程度组与对照组方面优于物种或代谢物单一模型，表明通过使用宏基因组测序和代谢组学技术区分能力有所提高。此外，通过分别评估那些差异的物质和代谢物，确定了几个对特定慢性肾脏病严重程度组具有临床有效性的个体标记物。其中，与尿蛋白/肌酐比值(AUC，0.64)或血清尿素(AUC，0.72)相比，蛋类杆菌对早期CKD的AUC(0.80；95%CI，0.67~0.93)更高。ag真人平台官方的结果揭示了通过特定的肠道微生物早期诊断CKD的有希望的途径。

 

 

肠道菌群失调及其相关的宿主代谢和炎症改变可能决定了CKD的发生发展。然而，最近关于人类肠道微生物群在CKD上的研究一直是基于16SrRNA，主要集中在疾病的晚期。因此，对CKD微生物群进行深入的分类和功能鉴定是非常有必要的。在这里，ag真人平台官方在物种水平上确定了特定的肠道生物失调及其相关的功能转移，并与CKD不同阶段的循环代谢物有很强的相关性。这些联系突出了肾功能障碍进展过程中潜在的宿主-微生物-代谢物相互作用。

此外，ag真人平台官方还鉴定了与宿主血清代谢物改变有关的肠道微生物种类。有趣的是，基于每种微生物和代谢物之间的联系，MCFA和SCFA可以分为两个不同的簇，二级胆汁酸可以从初级胆汁酸中分离出来，这些微生物-代谢物组合很可能与物种的丰度和在CKD发展过程中受到扰动的代谢物之间的机械关系一致，可能表明该物种产生了该代谢物，或者该代谢物促进/抑制了该物种的生长。

综上所述，最后ag真人平台官方的发现在物种水平上建立了对CKD不同阶段肠道微生物区系与宿主代谢之间关系的全面理解，为基于微生物组的肾脏损害的诊断和方式提供了潜在的途径。

 

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DOI：

Integrative metagenomic and metabolomic analyses reveal severity-specific signatures of gut microbiota in chronic kidney disease