药学CMC视角丨华测医药提供多肽药物手性氨基酸异构体检测服务

多肽药物的质量研究中，D-氨基酸异构体是极为棘手的一类杂质。无论是固相合成中氨基酸活化时的消旋化，还是制剂储存期间通过琥珀酰亚胺途径的渐进式异构化，这类杂质的生成一旦超出限度，即需进行严格的定性定量分析。

技术项目难点：D-氨基酸异构体与主成分色谱行为非常接近，理化性质高度相似，在常规反相色谱中往往与主峰“如影随形”，给分离和检测带来极大困难，D-型与L-型氨基酸异构体的准确定量，一直是多肽分析领域公认的技术难点。

国家药监局药审中心《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》给出了一条差向肽类杂质的分析路径：使用氘代试剂水解多肽（例如氯化氘（DCl）/氘代水（D2O），采用Marfey试剂（FDAA）、邻苯二甲醛（OPA）或三氟乙酸酐（TFAA）等对水解后的氨基酸进行衍生，采用相应检测手段测定每个氨基酸手性异构体的含量。

华测医药基于上述技术思路，依托高分辨液质联用平台，建立了覆盖多肽药物D-氨基酸异构体分析的系统化解决方案。

 

一、研究核心环节

图1. 研究流程示意图

01消除酸水解引入的“伪迹”

要进行D-氨基酸异构体分析，首先需将多肽链断裂为游离氨基酸，然而，酸水解本身就会诱导肽链中部分氨基酸残基发生构型翻转，产生所谓“水解伪迹”（Hydrolysis Artifact）。这些由前处理引入的人工D-氨基酸若不加以区分，将与样品中原生的手性杂质混为一谈，直接影响数据可靠性。

校正策略：采用氘代盐酸/重水（DCl/D₂O）水解体系。其原理如图2所示，若某氨基酸在水解过程中发生构型翻转（即次生消旋），其α-碳上的氢会被氘原子（D）取代，产生+1 Da的质量漂移；而肽链中原生的D-氨基酸则保持原分子量不变。借助高分辨质谱（HRMS）的精确质量数提取，可选择性排除水解伪迹的干扰，仅对非氘代的目标D-异构体进行定量。

 

图2. 冻干多肽在6 N氘代盐酸中的水解示意图（Zhang, Baole., et al. 2023）

 

02低浓度样品构型反转的应对策略

研究发现，极低浓度的样品在酸水解过程中，D型氨基酸会向L型发生构型反转。以司美格鲁肽为例，在司美格鲁肽注射液加速稳定性的杂质分析中发现，当离线收集的目标杂质（浓度约100 ng/mL）进行水解后，无论实际样品还是D型标准品，检测结果均显示为L型。

样品水解浓度	D构型检测结果
≥ 25 μg/mL	保持良好，D型可明确检出
10 μg/mL	L型开始出现
1 μg/mL	L型成为主导，D型勉强可辨
100 ng/mL	D型几乎不可见

极低浓度下，待测物缺乏足够的分子保护，在水解过程中发生了从D向L的逆消旋化。引入底物保护策略，可消除低浓度构型反转干扰。

03FDAA衍生化

由于D/L-氨基酸对映体在常规反相柱上无法直接分离，可采用FDAA（1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺，即Marfey试剂）进行柱前衍生化。

图3. 氨基酸FDAA衍生化及α-氘保留机制（Zhang, Baole., et al. 2023）

机制说明：FDAA的L-丙氨酰胺部分与D/L-氨基酸的α-氨基反应后，形成具有不同空间构型的非对映体衍生物。这些衍生物在普通C18反相色谱柱上即可获得良好的色谱分辨率。该方法无需昂贵的手性专用柱，且FDAA衍生物在ESI源中离子化效率高，完美兼容LC-HRMS检测。

04高分辨质谱检测与数据确证

采用高分辨质谱仪（Q-Orbitrap或Q-TOF），在全扫描模式下提取目标氨基酸FDAA衍生物的特征精确质量数，结合保留时间确认（通过与D/L-氨基酸标准品比对）和同位素分布鉴别，可有效排除复杂基质中的假阳性干扰，相关检测方法同时进行方法学验证。

 

二、结语

华测医药依托先进的质谱平台与丰富的多肽分析项目经验，致力于为客户提供以下多肽类型药物检测及研究服务：

•结构确证：精准测定多肽序列、二硫键连接及复杂修饰位点。

•手性氨基酸异构体检测：提供多肽原料药及制剂中各氨基酸残基的D-型含量测定。

•杂质鉴定：系统解析工艺与降解杂质，追溯来源，助力工艺优化与质量控制。

•方法开发与验证：建立并验证可靠、合规的有关物质检查方法。

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