复杂制剂质量研究｜聚焦寡核苷酸药物，结构表征与质量研究新突破

寡核苷酸药物因其复杂的化学修饰、多样的杂质谱以及严苛的法规要求，为药物开发与质量控制带来了显著挑战，行业的共识与痛点包括：

• 结构复杂：硫代磷酸酯（PS）、2'-OMe、2'-F、吗啉取代（PMO）、GalNAc偶联等修饰虽提升稳定性与靶向性，但也增加结构确证难度。

• 高级结构：除一级结构外，可能形成高级结构或聚集体。

• 杂质难分：缺失序列（n-x）、插入序列（n+x）、磷酸二酯（PO）杂质等与主成分性质相近，分离鉴定困难。

• 法规严苛：国内外监管机构（NMPA/EMA）均发布专门指南，要求采用多种正交分析方法进行全面表征。

为此，华测医药整合成熟的分析平台与项目经验，推出 “寡核苷酸药物精准分析与质量控制解决方案”，覆盖结构确证、分子量测定、序列确认、高级结构解析、稳定性测试及杂质分析等核心环节。

 

一、寡核苷酸药物结构确证和杂质研究技术

EMA与NMPA相关指导原则均强调，应使用多种技术对寡核苷酸进行全面表征。以下为常用分析方法示例：

 

寡核苷酸药物表征技术示例表

检测项目	推荐分析方法
分子量测定	LC-MS、MALDI-TOF MS、ESI-TOF MS等
序列分析	LC-MS/MS、酶解LC-MS、失败序列分析（如IP-HPLC-TOF-MS）
反离子分析	ICP-OES（电感耦合等离子体发射光谱）、FAAS（火焰原子吸收光谱）、ICP-MS
消光系数	UV
光谱特性	CD、FT-IR、31P NMR、19 F NMR、13 C NMR、1 H NMR
解链温度Tm	紫外光谱
双链结构*	IPRP-HPLC-UV
热力学转变	DSC、TGA
三级结构**	近紫外圆二色谱法
生物学特征分析**	基于细胞及其他生物学测定法

*适用于siRNA双链体，**适用于适配体或与具有三维结构的部分（例如抗体-寡核苷酸偶联物）偶联的寡核苷酸

 

寡核苷酸杂质主要包括产品相关杂质（如n‑x/n+x、核苷酸连接与糖环修饰杂质等）与非寡核苷酸杂质（如工艺残留、元素杂质、致突变杂质等）。EMA同样建议组合正交技术实现有效分离鉴定。

 

杂质分析技术手段

检测项目	推荐分析方法
产品相关杂质	LC-MS、IP-RP-HPLC、IEX-HPLC、CE、SEC、HILIC
立体异构体	色谱法、离子淌度质谱、CE、核磁共振、圆二色谱等
非寡核苷酸杂质	GC-MS、ICP-MS、HPLC-UV/MS

 

二、寡核苷酸药物结构确证与高级结构解析

1. 一级结构确证

重点确认核苷酸序列，包括碱基、核糖、骨架组成、连接位点及反离子。

• 分子量测定与序列确认：使用高分辨质谱（如LC-TOF/MS、Orbitrap）测定完整分子量，结合LC-MS/MS（酶解或化学裂解）验证序列与修饰位点。

• 失败序列分析：通过分析合成过程中产生的截短或缺失片段（如采用IP-HPLC-TOF-MS），反向验证合成路径的效率与准确性。

• 核磁共振波谱：利用 ¹H、³¹P、¹⁹F、¹³C NMR 等技术，直接解析碱基、糖环、骨架组成与修饰。³¹P NMR适用于区分PO与PS键。

• 元素与反离子确认：采用电感耦合等离子体发射光谱/质谱（ICP-OES/MS） 或原子吸收光谱（AAS） 定量钠、钾等反离子，辅助结构确证。

 

2. 高级结构与聚集倾向分析

高级结构可能影响功能与稳定性，欧洲制药寡核苷酸联盟（EPOC）2025年综述系统提出评估策略。

• 圆二色谱（CD）：快速、灵敏地反映溶液中的二级结构信息（如A/B型双螺旋，G-四链体等），并可通过变温实验研究结构稳定性。

• 紫外熔解曲线分析：测定Tm值，评估双链或高级结构的热稳定性。

• 分析超速离心（AUC）：在近天然状态下研究聚合状态、复合物化学计量及沉降行为。

• 尺寸排阻色谱联用多角度光散射（SEC-MALS）：在非变性条件下测定流体力学半径、绝对分子量及分布。

• 核磁共振：¹H NMR可用于观测碱基配对，区分发夹、G-四链体等结构。

• 其他辅助技术：动态光散射（DLS）用于初步评估粒径与聚集趋势；原子力显微镜（AFM）或透射电镜（TEM）可直接观察聚集体的形态。

 

三、原料药杂质谱分析：正交色谱技术联用

杂质控制是质量研究核心，EPOC与NMPA均强调需组合不同分离机理的方法。NMPA相关指导原则指出，产品相关杂质的报告限一般为0.2%，鉴定限1.0%，界定限1.5%。

 

1.    产品相关杂质分析

• 离子对反相液相色谱（IP-RP-HPLC）：最常用方法，尤其适合分离长度差异杂质（如n-1、n+1），常与LC-MS联用作为鉴定“金标准”。

• 离子交换色谱（IEX-HPLC）：基于电荷差异分离，对区分PO杂质效果显著，可作为IP-RP的正交方法。

• 亲水相互作用色谱（HILIC）：适用于极性杂质的分离，提供与反相色谱不同的选择性，有助于分离某些共流出的杂质。

• 二维液相色谱（2D-LC）：结合IEX与IP-RP等模式，显著提升分离能力，解决共流出问题。

• 毛细管电泳色谱（CE）：分离效率高，可产生更高的峰型，适用于高分辨杂质分析。

 

2.    立体异构体分析

硫代寡核苷酸因磷硫键手性，为2ⁿ个非对映异构体混合物，需评估其分布与重现性。可采用手性离子对色谱、离子交换色谱、毛细管电泳或离子淌度质谱进行监测。

 

 

四、华测医药寡核苷酸药物一体化解决方案

华测医药构建了完整的寡核苷酸药物分析技术平台，配备国际先进的仪器设备，能够为客户提供从早期研发到注册申报的全流程支持。

核心设备平台：

• 质谱平台：高分辨质谱（LC-TOF/MS）、LC-MS/MS、ICP-MS等

• 光谱与波谱平台：CD、FT-IR、UV等

• 分离分析平台：2D-LC、IP-RP-HPLC、SEC、CE等

• 高级表征平台：AUC、DSC、TGA、激光粒度仪等

 

覆盖药物开发周期的服务内容：

• 起始物料与中间体质量控制（如核苷亚磷酰胺的结构、纯度与杂质分析）

• 原料药一级结构确证（分子量、序列、修饰位点、反离子）

• 高级结构解析（二级/三级结构、Tm、聚集倾向评估）

• 深度杂质谱研究（产品相关与工艺杂质、残留溶剂、元素与遗传毒性杂质评估）

• 含量测定（UV-HPLC或LC-MS法）

华测医药基于对行业共识与国内外指导原则的深刻理解，结合丰富项目经验，致力于为寡核苷酸药物开发者提供科学、系统、合规的分析服务，助力加速研发进程，保障产品质量与患者安全。