药物分析丨多肽蛋白质Edman降解法N端测序全解析

生物药主要包括蛋白质、多肽、抗体、疫苗等产品，通常是通过生物技术生产的或在生物体内存在的天然活性物质，这些多肽蛋白质的生物合成途径均起始于N端，而且N端序列的组成对多肽蛋白质的生物学及药效功能有着巨大的影响，例如蛋白质的半衰期，亚细胞器中的定位等。

 

同时，研究发现多肽蛋白质N端可能发生多种翻译后修饰，这些修饰与蛋白质的功能和稳定性也是息息相关的，因此多肽蛋白质N端序列分析及确认有利于帮助解析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。随着生物医药产业的快速发展，出现了大量的蛋白质和多肽类的生物药物分子，对这些蛋白质多肽类药物分子的N端序列确认是生物医药工艺中质量控制的重要环节。

 

 

2025版《中国药典》三部人用重组DNA技术产品总论中对生物药物生物及质量控制方面，N端序列分析已经成为上市生物药的年检项目，包括注射用人促红素、注射用人干扰素、外用人表皮生长因子、尼妥珠单抗注射液、人胰岛素等各种重组蛋白产品。此外，药品注册国际协调组织颁布的指导法规ICH-Q6B及欧洲药典等国际法规及组织也要求多肽蛋白质类生物药物必须提供N端序列。

 

Edman降解法N端测序是多套蛋白质N端序列分析的金标准。目前，对蛋白质N端测序分析方法主要分为两类，其一为质谱法，即通过LC/MSMS采集的数据与理论序列进行匹配，进而确认N端序列；其二为化学法，如经典的Edman降解法，不需要借助蛋白数据库可以直接进行序列分析。两种方法都各有所长，相互印证。传统的质谱测序法不能对数据库中不包含的蛋白质进行测序，并且也不能够准确区分分子量相近的氨基酸（I/L、Q/K），以及蛋白质上的突变位点，而Edman降解法N端测序可以直接分析蛋白质多肽样品的N端序列，不需要数据库，对全新的没有数据库信息的蛋白质多肽同样可以进行N端序列分析，同时，该方法样品用量少，灵敏度高，结果更加准确，因此，采用经典的Edman降解N端序列分析方法在市场上较为普遍。

 

华测医药药品检测服务采用岛津公司最新的基于Edman降解法N端自动测序仪PPSQ-53A，相对于PPSQ-33A/B，其灵敏度更高(10倍)，所需要的样品量仅需50-100pmol。该仪器新PPSQ软件可配置为满足实验室的各种需要，无论是监管、研究和开发，还是学术。该软件符合FDA 21 CFR Part 11指南对安全、用户管理和审计跟踪的要求。

 

图1 岛津公司PPSQ-53A

 

一、Edman降解法N端测序原理

Edman降解法是异硫氰酸苯酯（PITC）在弱碱（TMA）条件下与蛋白质N端的α氨基偶联生成苯氨基硫甲酰肽（PTC-蛋白质），然后在无水强酸（TFA）条件下，N端的第一个残基从完整的多肽蛋白链上以2-苯氨基噻唑啉酮（ATZ-AA）的形式裂解下来，之后在稀酸条件下，ATZ-AA转化为更加稳定的苯基乙内酰硫N脲衍生物，即PTH-AA，其反应原理图如图2所示。生产的PTH-AA输送至高效液相色谱中进行在线分析，剩下的蛋白质多肽供试品可反复依据上述步骤进行，依次生产各种PTH-AA，由此可测定多肽蛋白质供试品的N端氨基酸序列。

图2 Edman降解法示意图

 

二、案例分享

蛋白样品的N端测序结果：

氨基酸标准品谱图：

 

 

蛋白质每个循环氨基酸谱图：

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氨基酸序列测定：