高分子结构鉴定｜多肽类药物结构确证和杂质鉴定分析服务-CTI华测检测官方商城

多肽是由多个氨基酸通过酰胺键相连形成的化合物，可通过基因重组表达、生物提取、化学合成等方法制备。目前绝大多数多肽药物为化学合成，因此必须对其一级结构、高级结构及相关杂质进行系统确证与鉴定，以确保药物的有效性与安全性。

华测医药CMC服务凭借先进的质谱平台与专业的技术团队，为多肽药物的研发与质量控制提供全面、可靠的分析研究服务，核心能力涵盖：

- 多肽分子量测定

- 多肽序列确认

- 氨基酸组成分析

- 二硫键定位与确认

- 翻译后修饰（如脂肪酸修饰）位点确认

- 有关物质检查方法开发与验证

一、多肽的结构确证

多肽的生物学活性由其结构决定，包括氨基酸序列、二硫键位置及空间构象等。错误的结构不仅会导致活性丧失，还可能引发不可预知的免疫反应。因此，结构表征是多肽药物质量控制的基石。由于多肽分子量较大，传统小分子药物结构研究方法（如紫外、红外、核磁共振等）解析能力有限。需采用更具针对性的技术手段，重点确证其一级结构（氨基酸序列及修饰），并酌情分析其高级结构。常用多肽结构表征方法见表1。

方法	主要适用性
RP-HPLC	肽图
Edman降解法	N端序列
自上而下MS	氨基酸序列、二硫键、翻译后修饰
氢/氘交换质谱	序列覆盖率、高级结构、构象动力学
圆二色谱法	二级、三级结构
傅里叶红外光谱法	二级结构
拉曼光谱法	二级结构
核磁共振波谱法	可溶蛋白质的三级结构
荧光光谱法	构象变化（三级）
X射线衍射法	结晶蛋白的三级结构
冷冻电镜技术	三级结构
非变性质谱法	蛋白质与其他分子相互作用
离子淌度质谱法	异构体分析

表1. 多肽类药物结构表征方法

二、多肽相关杂质

多肽相关杂质（或称有关物质）是指与目标多肽结构相似的杂质，是评价化学纯度的关键指标。这些杂质可能来源于起始物料、合成副反应、纯化工艺或储存过程。图1概括了多肽制备过程中可能产生的杂质类型。

图1. 多肽工艺流程及可能产生的杂质

多肽杂质的常见类别与来源如下表所示，实际分析中需结合具体产品进行评估。

类别	描述	来源
缺失肽	缺少一个/多个氨基酸	合成或降解
插入肽	存在一个/多个额外的氨基酸	起始物料或合成
错结肽	存在一个/多个（与目标序列）不同的氨基酸	起始物料或合成
差向肽	存在一个/多个差向异构化的氨基酸	起始物料，合成或降解
Asp/Asn 相关	含Asp/Asn环化、β-Asp、异构体或断链产物	合成或储存过程中的化学变化
焦谷氨酸	含有 N 端谷氨酰胺或谷氨酸的序列	合成
聚合物	端基具有反应活性或为二硫键改变等引发肽聚合	合成或降解
含硫杂质	巯基氧化二硫键氧化或还原	合成或降解
其他	谷氨酰胺、门冬酰胺或 C 端的脱酰胺	合成或降解
其他	氨基官能团的乙酰化	合成或降解

三、案例分享：基于液质联用技术的司美格鲁肽一级结构测定

司美格鲁肽是一种长效GLP-1受体激动剂，其结构经过巧妙设计以提升稳定性和延长半衰期。与天然GLP-1(7-37)相比，其主要修饰包括：(1) 第8位丙氨酸被替换为2-氨基异丁酸(Aib)，以抵抗DPP-4酶降解；(2) 第26位赖氨酸连接一个脂肪二酸侧链，通过结合白蛋白显著延长体内半衰期。

图1. 司美格鲁肽结构

以下介绍使用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF MS）对其一级结构进行测定。

a)完整分子量确认：高精度匹配

一级质谱分析显示，司美格鲁肽实测分子量 [M+H]⁺为 4112.1414 Da，与理论值 (4112.1227 Da) 偏差仅 4.5 ppm，精准证实了目标分子的正确性。

图2 司美格鲁肽一级质谱图

b) “自上而下”序列覆盖：100%无死角

通过对比不同能量范围（10-50 eV）下产生的b/y离子总数，最终确定20-30 eV的梯度碰撞能为最优条件，在此条件下产生的碎片离子数量最多、信号强度最佳。基于此优化方法，成功获取了覆盖司美格鲁肽全序列的丰富碎片离子。经数据处理软件解析，共匹配到52对高可信度的b/y离子，实现了100%的肽段序列覆盖。

图3 司美格鲁肽二级离子覆盖图

c)关键修饰位点精准定位

质谱碎片离子分析显示，y10与y12&（或b19与b21&）离子之间存在一个质量差，该差值对应着包含赖氨酸-谷氨酸序列段和整个脂肪二酸侧链。这表明，酰化修饰就发生在这两个氨基酸所在的区间。从化学反应机理上判断，谷氨酸的侧链羧基无法发生该酰化反应，而赖氨酸侧链的氨基正是已知的、可与脂肪酸发生定点酰化的位点。因此，质谱数据锁定的“K-E”区间，结合反应机理，最终将修饰位点精确地定位在赖氨酸残基上。

四、案例分享：液质联用技术精准鉴定多肽缺失杂质

醋酸阿托西班是一种化学合成九肽，在合成过程中易引入多种工艺相关杂质。这些杂质与目标肽结构高度相似，但其潜在生物学活性可能迥异，需进行精准鉴定与严格控制。

图4. 醋酸阿托西班结构

以下介绍使用超高效液相色谱－高分辨质谱联用技术对阿托西班杂质馏分中的杂质结构进行鉴定。

a)杂质分离与针对性前处理

首先通过HPLC成功分离出目标杂质峰。由于阿托西班含有一对二硫键，会干扰质谱碎片解析，我们首先采用还原烷基化策略（DTT还原，IAA烷基化）打开并封闭二硫键，为后续获得清晰的序列碎片信息奠定基础。

图5. 醋酸阿托西班样品有关物质图谱

b)杂质结构的精准解析

一级质谱定位差异：杂质1的分子离子峰m/z 897.40（z=1）、449.20（z=2），如图5-A所示。还原烷基化后，分子离子峰m/z 897.40变为1013.45（z=1）、507.23（z=2），如图5-B所示。经计算该杂质与阿托西班相比，相对分子质量减少约97。提示可能存在一个氨基酸的缺失。

二级质谱指认位点：根据二级图谱中肽键裂解规律，对b、y碎片离子进行解析，发现从y3碎片离子开始，y系列离子相对分子质量均减少97，与脯氨酸残基相对分子质量一致，而且y2离子无变化，如图5-C所示，因此，确证该杂质为缺失了一个脯氨酸(Pro)的缺失肽。