医药探秘｜接轨国际！中国药典9251引入LER，内毒素检测迎来新挑战

低内毒素回收（LER）作为生物制品质量控制中的关键风险点，其检测与研究已被全球主流监管机构纳入强制合规范畴。LER是指使用细菌内毒素检查法(BET，鲎试剂法）检测时，添加到无菌生物制品中的标准内毒素随时间延长回收率低于50%的现象，与常规检测干扰不同，其具有时间依赖性、工艺相关性，无法通过稀释消除，可能导致致热风险产品流入市场。

 

一、全球法规核心要求与PDA TR82的衔接

PDA TR82的核心逻辑已被全球主流监管机构认可，成为法规要求的技术支撑，二者共同构成 LER 合规的 “双保障”。

01 美国 FDA

• 2013年起明确要求：生物制品提交生物制品许可申请（BLA）时，必须提供完整的LER研究数据；

• 若BET法因LER无法准确检测，需用替代方法（如家兔热原实验、rFC法）并完成验证；

• PDA TR82衔接点：FDA审评中直接参考 TR82 的风险评估与实验设计逻辑，要求研究覆盖产品全生命周期。

02 欧洲

• EMA2023年9月《生物制品问答》明确：含表面活性剂（聚山梨酯20/80、LDAO）或螯合剂（柠檬酸盐、EDTA、组氨酸）的制剂，MAA申报需补充 LER 研究数据；

• PDA TR82衔接点：EMA要求LER研究遵循TR82的 “基质成分分析 + hold-time 研究” 规范，高风险辅料组合需按标准实验设计开展。

03 中国监管要求

• 2025版《中国药典》9251《细菌内毒素检查法应用指导原则》新增 LER 技术要求；

• 《药品GMP指南（第2版）》将LER控制纳入生物制品下游工艺质量控制核心要求。

04  PDA TR82 核心原则

• 适用范围聚焦：核心针对蛋白类药物，疫苗、基因治疗等产品可参考其框架设计研究；

• 风险评估优先：从辅料成分、工艺参数、给药途径、储存条件三维度分级，高风险产品需全面研究，低风险可简化；

• 专项研究独立性：LER hold-time研究与QC样品采样 - 检测最大允许时间验证严格分离，后者属 GMP 通用要求，可单独进行；

• 方案合规要求：用于BLA/MAA申报的LER研究，需制定经质量部门预批准的专项方案，明确接受标准；

• 替代方法验证：BET法失效时，替代方法需按TR82要求完成等效性验证。

 

二、需要做 LER 研究的产品类型

01 生物制品核心品类

• 监管重点核查对象单克隆抗体（单抗）、治疗性融合蛋白、细胞治疗产品：这类产品生产中普遍添加表面活性剂与螯合剂，是LER最高发领域，FDA、EMA均明确要求其注册申报必须提交LER数据；疫苗、重组蛋白药物（如胰岛素、生长激素、干扰素）：多为注射给药，直接进入人体循环，内毒素漏检风险后果严重，2025版《中国药典》要求上市前完成LER验证；

• 其他无菌生物制品：血液制品、基因治疗药物、免疫球蛋白等，均需在注册申报阶段提供完整的 LER 研究报告。

02 含高风险辅料的制剂（LER 诱导确定性强）

• 含 “表面活性剂 + 螯合剂” 组合：如聚山梨酯（20/80）+ 柠檬酸盐、聚山梨酯 + 磷酸盐、聚山梨酯 + 组氨酸等（约 70% 蛋白制剂含聚山梨酯，是 LER 主要诱因）；

• 含单一高风险辅料：部分两性表面活性剂无需螯合剂辅助，可单独诱导LER（已被实验证实）；含组氨酸的制剂也被证实存在 LER 诱导风险。

03  高风险给药途径制剂

• 静脉注射、椎管注射、肌内注射等直接进入人体的粉针、水针、输液剂；

• 植入医疗器械配套给药制剂、透析用制剂：这类产品与人体直接接触且内毒素限量严格，LER研究是合规上市的前置条件。

 

三、LER与内毒素干扰的核心区别

对比维度	常规内毒素干扰	LER（低内毒素回收）
表现形式	抑制或增强检测（回收率 <50% 或> 200%）	仅内毒素可检测活性随时间下降，回收率持续 < 50%
关键特征	浓度依赖性，干扰程度与物质浓度正相关	温度 + 时间依赖性，随工艺时间延长、温度升高恶化
干扰可逆性	可逆，可通过稀释消除	不可逆，稀释无法解除内毒素掩蔽
时间影响	无时间依赖性，干扰即时稳定	强时间依赖性，加标后孵育一定时间显现并持续恶化
确定方法	干扰试验（筛查 + MVD 确定）	hold-time 研究 + 基质成分分析（TR82 标准化方案）

 

四、LER 发生机制可能包含

1、对螯合剂 + 表面活性剂体系导致LER,可能机制：

• 第一步：螯合剂（如柠檬酸盐）与溶液中 Mg²+/Ca²+ 结合，破坏内毒素分子的天然聚集状态；

• 第二步：表面活性剂（如聚山梨酯）与内毒素脂质 A 部分结合，形成稳定复合物，遮挡内毒素与鲎试剂的反应位点，导致检测活性丧失。

2、蛋白介导的内毒素掩蔽

部分治疗性蛋白可通过疏水作用与内毒素结合，形成蛋白 - 内毒素复合物，同样导致 LAL/rFC 法无法检测。该机制与辅料诱导的 LER 类似，均具有时间和温度依赖性，但无需螯合剂参与。

 

五、LER 研究实施路径

TR82 提供了标准化的 LER hold-time 研究方案：

1、前期准备：风险评估与参数确定

hold-time 研究参数（聚焦工艺相关条件）：

• 根据产品工艺信息，确认产品hold-time研究参数（温度，考察时间点等）；

• 向未稀释样品中加入一定浓度的内毒素；

• 在特定的时间点进行内毒素检测；

• 计算回收率，数据分析，是否存在LER现象；

2、判定标准：

• 无 LER：所有时间点回收率 50%-200%，无持续下降趋势；

• 存在 LER：连续 2 个及以上时间点回收率 < 50%，或单个时间点回收率 < 30%（TR82 警示阈值）；

3、LER 应对策略

（1）预处理方法

• 化学预处理：添加 Mg²+/Ca²+ 离子（破坏内毒素 - 螯合剂结合）、调整 pH 至 6.0-8.0（减少内毒素聚合）等；

• 物理预处理：稀释加热法（37-60℃加热 10-30 分钟，分离内毒素 - 辅料复合物）等；

• 专用试剂预处理：使用分散剂等；

• 验证要求：预处理后回收率需在 50%-200%。

（2）处方与工艺优化

• 处方优化：用低风险辅料替代（避免高风险辅料组合；

• 工艺优化：缩短灌装后至放行的时间间隔，降低工艺储存温度，减少内毒素掩蔽机会。

（3）替代方法验证

• MAT法进行内毒素测试；

• 家兔热原实验：仅在体外方法均失效时使用，需满足药典要求（样本量≥3 只，升温≤0.6℃）；

• 验证核心：替代方法需与 BET 法进行等效性验证，确保内毒素检测准确性。

 

六、哪些成分可导致LER

高风险成分清单

成分类型	具体成分
表面活性剂	聚山梨酯 20/80、LDAO
螯合剂	柠檬酸盐、EDTA、磷酸盐
缓冲剂	L - 组氨酸（≥20mM）
其他	两性离子聚合物

 

七、总结

低内毒素回收（LER）已成为生物制品合规上市的核心控制点，PDA TR82 作为全球公认的技术指南，从科学机制、实验设计、合规要求到应对策略，提供了全流程标准化框架。企业需严格遵循其核心原则，明确 “蛋白类产品核心适用、其他产品参考适用” 的边界，通过科学的风险评估和实验设计，有效控制内毒素漏检风险。