药物分析丨告别标准品依赖！生物药聚集体绝对分子量如何精准测定？

聚集体分析是生物药质量研究的一项重要内容，近年来在生物药物质量控制研究中越来越迫切。多肽、蛋白、抗体、核酸等生物药物在生产、储存和运输中容易产生聚集体，生物药聚集体不仅会降低疗效，往往还会产生细胞免疫等副作用，因此,聚集体是生物药杂质最需要关注的，需要对其进行鉴定和质量控制。

常规GPC方法中，分析绝对分子量需要一系列分子量标准品，且测定结果因为色谱柱、流动相等因素造成结果不准确；高分辨质谱分子量检测要求样品及流动相中不能含离子性缓冲盐，否则会严重污染质谱，实际分析往往需要改变缓冲液体系。因此，上述两种方法均不适用，不建议采用上述两种方法。

光散射是测量聚合物、蛋白质、多肽以及其他多种复杂结构大分子的绝对分子量以及尺寸的最常用表征手段。SEC-MALS能够直接对缓冲盐体系下的大分子药物和聚集体进行绝对分子量测定。生物药物通过SEC (Size Exclusion Chromatography尺寸排阻色谱) 分离后进入多角光散射检测器(MALS)，激光照射到分析物时会发生光的散射，MALS通过多个角度同时测定散射光的强度，散射光强度正比于摩尔质量、浓度、折光指数增量的平方，从而直接可以计算出分析物的绝对分子量。

SEC-MALLS

TOSOH LenS3多角度光散射检测器

多角度光散射检测器原理

SEC-MALS技术特点：

1. 准确度高

2. 无需标准蛋白或聚合物

3. 不依赖于洗脱保留时间

4. 直接准确测定绝对分子量

5. 缓冲盐无干扰

华测医药利用岛津液相色谱系统联用TOSOH LenS3多角度光散射检测器，构建了SEC-MALS分析平台，该平台不仅能够实现对生物药聚集体的分析测定，还能测定多糖、高分子化合物的绝对分子量及其分布。

案例：

抗体聚集体分析

备注：线性良好，可以检测到mAB片段，二聚体，三聚体

寡核苷酸的表征-20mer (6KDa)

备注：左边为未纯化前样品，右边为纯化后样品

寡聚体聚苯乙烯聚合物分析

参考文献：

[1]Tosoh Bioscience LLC. The Evolution of Light Scattering Detection; LCGC July 20, 2021